冻干工艺设计：你退火了吗？

如果你对样品外观不满意，要获得更佳的样品性状，改善产品的溶解性，那么请看此文；如果你认为目前的冻干曲线冗长，要缩短冻干时长，减少人力和物力成本，那么请看此文；如果你的冻干样品参差不齐，你想要获得均一的样品，那么请看此文。

说起冷冻干燥，退火这个词我相信各位看官都不陌生，但是退火到底是什么意思？冻干样品什么时候需要用到退火？又该如何在实战中炉火纯青的运用退火？

退火是指以一定的升温速率把样品从预冻的终温加热到高于玻璃化转变温度而低于其共熔点的某一特定温度，并保持一段时间，然后再以一定的降温速率把样品冷却到预冻终温的过程。简单来说，就是在预冻阶段，把样品冻结后，又将样品加热到介于玻璃化和熔化的状态，并保持一段时间，再降温将样品冻结实。

在这里，介绍一下退火过程中样品的物态变化，在冻干开始前，样品是液态的。预冻过程中，随着隔板温度降低，样品温度也随之降低，降低到共晶点以后，开始结晶。随着结晶的进行，未结晶的溶液中溶质成分逐渐增加，最终来不及结晶，以非晶态存在。在退火过程中呢，以非晶态存在的样品在温度越过玻璃化转变温度后以玻璃态存在，而已经形成的冰晶在退火温度不超过共熔点的前提下，不会熔化。当样品温度再次降低时，以玻璃态存在的样品会趋向于形成热力学更稳定的状态，于是出现更多的结晶形态。

我们了解了退火过程中样品的物态变化后，并可以解答第二个疑问。

解答冻干样品什么时候需要用到退火，我们先来看一下，退火有哪些优势：

1、 吉布斯-居里-乌洛甫的晶体生长表面能理论认为:晶体的平衡形状应当使晶体单位体积具有最小的总表面积自由能[1]，样品中来不及结晶的，以玻璃态存在的部分会趋向于形成热力学更稳定的状态，即形成表面自由能更低的状态，于是出现更多的结晶形态，例如：由表面自由能更大的片状或者层状向表面自由能更小的柱状或者球状转变。为研究预冻方式对丙氨酰谷氨酰胺冻干样品形态的影响，李代禧等[2]分析了快速降温预冻和多次变温退火预冻再冻干所得样品的扫描电镜图（Fig.1）。同时选择丙氨酰谷氨酰胺标准样品即原料药Fig.1A进行对比分析。Fig.1B为快速降温预冻冻干的丙氨酰谷氨酰胺冻干样品的扫描电镜图，发现快速降温预冻再冻干的样品，晶体较丙氨酰谷氨酰胺标准样品更细碎，颗粒小，大颗粒的样品较少，其原因是由于降温速率较快，导致短时间内药物分子的晶核形成较多，而晶体生长时间较短，最终丙氨酰谷氨酰胺分子形成了数目众多而体积细小的微晶,甚至有玻璃态药物存在。所以丙氨酰谷氨酰胺冻干样品粒度细小，结晶度较低。Fig.1C为多次变温退火预冻再冻干的丙氨酰谷氨酰胺冻干样品的扫描电镜图，发现样品经多次变温退火预冻处理再冻干，样品晶体粒度稍大。溶液中的药物经过二次浓缩和重结晶，粒度大、晶形和大小分布均匀。所以通过退火，使得样品中的结晶率提高，形成更稳定的结晶结构，这直接反应在样品的性状上。

2、 退火过程中，样品趋向于形成热力学更稳定的状态，使得更多非晶态成分转变为结晶态，提高结晶率。其中部分玻璃化转变温度较低的成分转变为结晶态，样品整体的玻璃化转变温度得以提高。整体的玻璃化转变温度提高后，允许在升华过程中使用更高的升华温度，缩短升华时间。Jun Yeul Lim等将退火工艺引入到蛋白质药物依那西普的冻干工艺中，发现退火能够抑制依那西普的蛋白聚合，晶体表面形成多孔结构，水分逸出更快，总的冻干周期被大大缩短了[3]。Wassim Abdelwahed等人采用退火工艺冻干一种纳米胶囊，并将其冻干晶型与未退火制品的晶型进行对比，发现退火冻干可提高冻干效率[4]。

3、 在冻干机中的位置不同，样品中微粒组成和数量不同会导致样品在不同成核温度产生不同的冰晶，由于在较宽的温度范围形成结晶，导致冰晶的形态存在差异，不同冰晶形态又会导致不同的升华速率[5]。通过退火，可以减小由于成核温度不同导致冰晶尺寸和大小不同的差异，提高干燥的整体效率和样品的均一性。kramer等对质量分数2%的氨基乙酸溶液进行冻干实验,并对冻干后样品的横截面形态进行显微观察,发现在-1℃退火4 h后,氨基乙酸的平均孔径从80μm增加到120μm,初次干燥时间从1030 min减少到790 min[6]。详见Fig2.质量分数2%氨基乙酸溶液冻干后横截面显微图(a.未退火；b.-1℃退火4 h)

好了，现在回到冻干样品什么时候需要用到退火？1、对样品外观不满意，要获得更佳的样品性状，改善产品的溶解性；2、升华时间长，要缩短冻干时长，减少人力和物力成本；3、冻干的样品参差不齐，要获得均一的样品。如果你有上述3点需求，那么请尝试采用退火。

关于退火如何运用到实战中，有如下5点建议：

1、 退火温度必须高于样品的玻璃化转变温度，因为在玻璃化转变温度以下退火不会引起样品的非晶态基质的变化，冰晶的大小和形态也不会发生变化。因此在设定退火温度前，一定要知道样品的玻璃化转变温度。

2、 退火温度必须低于样品的共熔点，因为退火温度超过样品的共熔点以后，已经形成的结晶会出现熔化，对样品结晶造成破坏。因此，在设定退火温度前，要检测样品共熔点。

3、 晶体生长速度与退火温度有关，退火温度过高或者过低都不利于晶体生长。退火温度高，导致溶液粘度降低，质点移动阻力减小，更容易移动到晶核表面，有利于晶体生长。而退火温度高，使质点的动能增加，相互作用力相对减小，又不容易吸附到晶核表面，这又不利于晶体生长。因此退火温度，决定晶体生长速度。

4、 晶体的生长与退火时间有关，在一定退火温度下，退火时间越长，结晶越充分，退火时间足够长时甚至可以达到完全结晶。

5、 退火时间和退火温度对晶体生长的影响如下：退火温度越高，需要达到完全结晶需要的退火时间越短；退火温度越低，需要达到完全结晶需要的退火时间越长。例如：华泽钊等[7]研究了10%叔丁醇-10%蔗糖-水溶液在-25℃退火，玻璃化转变温度上升到-34.9℃；而在-40℃退火，延长退火时间后，玻璃化转变温度上升到-37℃，退火时间依赖退火温度，当退火温度接近玻璃化转变温度时，样品粘度很大，质点迁移需要时间很长，达到完全结晶需要的时间也很长。

因此，要达到完全结晶，提高玻璃化转变温度，需要摸索合适的退火温度，并保持足够的退火时间。

 

1.胡维杰,宁桂玲.结晶过程.大连理工大学出版社,1991.

2.李代禧,郭柏松.丙氨酰谷氨酰胺溶液预冻方式对冻干样品结晶度的影响. 中国药学杂志, 2016,11-0910－05.

3.Jun Yeul Lim, Dae Gon Lim, Ki Hyun Kim,Sang-Koo Park, Seong Hoon Jeong. Effects of annealing on the physicalproperties of therapeutic proteins during freezing drying process[J].International Journal of Biological Macromolecules. 2018(107)730-740.

4.Wassim Abdelwahed,Ghania Degobert∗,HatemFessi. Freeze-drying of nanocapsules: Impact of annealing on the dryingprocess. International Journal of Pharmaceutics 2006, 324:74–82.

5.周新丽,翁宇,陈光明.药品冷冻干燥进程的退火机理分析.化学工程,2005,33(6):4-7.

6.KramerM, Sennhenn B, Lee G. Freeze-dryingusing vacuum-induced surface freezing. Journal of PharmaceuticalScience, 2002,91(2):433— 443.

7. 左建国,华泽钊等：冻干保护剂溶液低温退火特性的研究.物理化学学报,2005,21(10):1178-1181.