抗糖尿病中药新药临床前有效性评价与思考（一）糖尿病（DM）动物模型

审评二部    黄芳华

    糖尿病是常见的内分泌系统疾病，近年来糖尿病的患病率显著上升，WHO报道2000年全球确诊的糖尿病患者大约1.5亿，预测2010年达到2.39亿，其中在发展中国家的增长速度要远大于其他国家。国内目前的糖尿病患者约有5000万，到2010年可能上升到1.2亿。由糖尿病并发症引起的死亡人数在发达国家已经列第3位（心脑血管和癌症之后），糖尿病已成为世界三大疾病之一，因此对该病的防治研究已经成为各国医药学界的重要课题。
    糖尿病主要分为1型糖尿病（胰岛素依赖型，Insulin-dependent diabetes ellitus 即IDDM）和2型糖尿病（非胰岛素依赖型，Non-insulin-dependent diabetes mellitus即NIDDM）。1型糖尿病为胰岛素的绝对缺乏，常是由于胰岛β细胞破坏致胰岛素绝对不足所致，该型糖尿病必须依赖胰岛素治疗为主。2型糖尿病主要是胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足所致。2型糖尿病占糖尿病的大多数，可占至90%以上，对2型糖尿病的药物治疗主要是利用药物控制血糖升高及防治并发症，目前临床上应用的降糖药物主要有磺脲类、双胍类、α糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类、非磺脲类胰岛素促分泌剂等。
    正是在这种背景下，用于糖尿病的中药新药越来越受到关注。近年来，申请用于糖尿病及糖尿病并发症的中药新药逐渐增多，尤其是从中药中筛选具有降血糖作用的药物及有效成分的研究工作进展迅速，已经成为研究热点和开发方向。但是由于糖尿病的病因病机复杂，临床前药效学试验也有一定难度，导致目前糖尿病中药新药临床前评价存在较多问题。从这些年来的申报临床的糖尿病中药品种分析，试验设计存在的最大问题是模型选择缺乏针对性，因此本文综述了目前糖尿病动物模型，以利于中药糖尿病药物有效性评价时进行选择。
    糖尿病模型主要分为三类：（1）实验性糖尿病动物模型；（2）自发性糖尿病动物模型；（3）转基因糖尿病动物模型。现对三类模型的特点进行阐述。[1、2、3、4]
1、实验性动物糖尿病模型
    实验性糖尿病模型是用各种方法损伤胰或胰岛β细胞导致胰岛素缺乏，或用各利拮抗剂拮抗胰岛素的作用，引起实验性糖尿病或实验性高血糖。
1、1 胰腺切除性糖尿病模型
  是最早的糖尿病模型复制方法。全部或部分切除实验动物的胰可引起胰岛素缺乏性糖尿病。因全部切除胰可致酮症酸中毒和死亡，故一般切除75%-90%的胰。可选用犬和大鼠进行手术，因狗易进行手术且术后感染少，常用犬进行。手术方法主要用于建立1型糖尿病模型。该模型缺陷是选择性欠佳，可引起其他胰腺内分泌激素如生长抑素、胰高血糖素、胰多肽的缺乏。
1、2 化学性糖尿病模型
    通过化学药物损伤胰脏可形成糖尿病模型，化学药物常用四氧嘧啶(alloxan)、链脲霉素(streptozotocin，STZ)，该两种药物均是β细胞毒性剂，可选择性损伤多种动物的胰岛β细胞，影响胰岛素合成，从而引起实验性糖尿病。注射后动物血糖水平变化通常出现三个时相：早期短暂的高血糖期；由于其破坏β细胞作用及胰岛素释放所致的低血糖相；由于β细胞损伤导致持久的高血糖。
    两种模型比较，链脲霉素引起的糖尿病高血糖反应及酮症较缓和，但引起的低血糖反应更为严重，致命性惊厥发生率高。因四氧嘧啶水溶液不稳定、容易分解失效，需临用前配制，给药途径可采用静脉注射、腹腔注射和皮下注射，最常用静脉注射，因其半衰期短，注射应快，通常应在30秒内注入。链脲霉素的水溶液也不稳定，室温下可在数分钟内分解为气体，因此应在低温和pH4条件下配制并保存，或用柠檬酸配制；其半衰期也短，应快速静脉注射。因禁食动物较不禁食动物敏感，两种动物模型建立前通常禁食24h。不同种属动物对药物的敏感性不同，而且随给药途径不同而不同，因此应根据种属、给药途径选择合适的剂量。在同一种属中糖尿病的严重程度主要取决于药物的剂量，如大剂量的四氧嘧啶/链脲霉素可直接使β细胞全部破坏，引起严重糖尿病，并可产生酮症酸中毒而死亡；低剂量时则可使部分破坏；多次小剂量注射STZ则可引发胰岛炎，形成免疫性1型糖尿病模型，这可能是STZ通过细胞介导的自身免疫反应所致。一部分啮齿类动物如大鼠和小鼠形成四氧嘧啶糖尿病可产生自发性缓解，即血糖经过一段时间后可恢复。该两种模型均属β细胞破坏型，类似于1型糖尿病模型，一般不宜用于2型糖尿病药物降糖作用的评价。
    目前，国内常用高脂饲料喂养加小剂量的STZ损伤部分β细胞造模进行中药降糖作用评价，例如采用大鼠高热量饲料喂养2个月后给予小剂量的STZ或先给予小剂量的STZ再加高脂饲料喂养，认为可建立具有外周胰岛素抵抗和胰岛功能轻度受损的糖尿病动物模型，从而认为与人2型糖尿病类似，用于2型糖尿病药物的研究。但是该模型建立时间长，易受多种因素的影响，如饲料的质量和口味、STZ的用量和注射方法等，使得模型稳定性不佳，目前国外基本不采用该类模型用于2型糖尿病药物的评价。
1、3 其他实验性糖尿病模型
    免疫性糖尿病模型：将抗豚鼠胰岛素血清注射于大鼠，使抗血清与大鼠的胰岛素发生中和反应，导致胰岛素缺乏并可持续数小时，产生一过性糖尿病症状。该处理仅使动物产生胰岛炎，不造成明显的β细胞坏死。因该模型为一过性，可自行缓解，因此观察药物作用时需选择好给药时间。
    其他：激素性糖尿病模型，例如注射垂体前叶提取物、生长激素、甲状腺素、胰高血糖素均可直接或间接产生糖尿病。肾上腺素高血糖模型，注射肾上腺素可致血糖升高，该模型造型方便、用血量少，但测定的血糖不完全是葡萄糖、专一性不强。病毒性糖尿病模型，如脑心肌炎病毒D变异株感染易感染小鼠如ICR Swiss小鼠导致胰岛β细胞破坏产生类1型糖尿病；DBAP2雌性小鼠皮下接种脑炎、心肌炎病毒M型变异株，4～7d后出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺中胰岛素含量降低。下丘脑性糖尿病模型，系用电凝法或注射硫代葡萄糖损伤丘脑下部腹内侧核(VMH)饱中枢,可使成熟动物产生过度摄食、肥胖,直至产生糖尿病。
这些模型在目前的新药有效性评价中较少使用。
2、自发性糖尿病动物模型
    自发性疾病动物是动物自然发生疾病，与人类某种疾病有相似之处，或通过遗传育种培养而保留下来的疾病动物。自发性糖尿病动物其临床表现与人类糖尿病相似，可用于研究糖尿病的病因和发病机制，也可用于筛选糖尿病药物及研究其作用机制，是较理想的糖尿病模型。
    不同的自发性模型有不同的发病机制，根据不同机制和临床病理表现，可用于不同类型的糖尿病药物的评价。如中国地鼠、BB大鼠、NOD小鼠等，有自身免疫病因参与、胰岛β细胞受损，因而胰岛素缺乏、血糖升高，主要用于1型糖尿病的病因及病理生理，及用于1型糖尿病药物如口服胰岛素制剂的有效性评价。胰岛素抵抗型自发性糖尿病动物则多数肥胖，有高胰岛素血症，类似人类2型糖尿病的特点，如db/db、ob/ob、T-KK、KK-Ay、NZO小鼠、Obese Zucker、Goto-Kakizaki(GK)、SHR/N-cp、OLETF大鼠等。国外开发口服抗糖尿病及并发症的新药多选用此类动物。但是，这些动物大部分需从国外引进，且需要较高的培养和饲养条件，动物价格较贵，目前在国内尚未广泛使用。
    因自发性动物模型较多，以下仅简介较为部分常用的模型：
2、1 NOD小鼠：是典型的胰岛素依赖性糖尿病模型，通常在100-200日龄之间突发糖尿病，表现为胰岛素降低、血糖升高，并迅速出现体重减轻、多尿、多饮及严重的糖尿病。这种糖尿病是继发于β细胞的自身免疫性损伤，并伴有胰岛炎和自身抗体生成。可用于1型糖尿病药物的评价。
2、2 BB大鼠：是和自身免疫性毁坏胰腺β细胞的胰岛炎及胰岛素缺乏有关的糖尿病模型，有常染色体隐性遗传的特性，为1型糖尿病模型。糖尿病发作突然，大约在60-120日龄时发病，出现严重高血糖、低胰岛素、酮血症。
2．3 KK小鼠：为多基因遗传的自发性糖尿病模型，中度肥胖、多食、多尿，血糖水平和血清胰岛素水平均升高，组织病理可见胰岛肥大、β细胞脱颗粒。
2．4  KK-Ay：为一种肥胖型2型糖尿病动物，是将黄色肥胖基因(即Ay)转至KK小鼠而得，为常染色显性遗传。与KK小鼠相比,有明显的肥胖和糖尿病症状。从5周龄起血糖、血浆胰岛素水平以及HbA1c水平逐步升高，胰岛组织对胰岛素的敏感性显著降低（较KK小鼠明显），至16周时几近完全丧失，胰岛β细胞有脱颗粒和糖原浸润，随后出现胰岛肥大和中心气泡。肝脂肪化和脂肪组织增多，肾脏可见早期迅速发展的肾小球基底膜增厚。该模型可用于胰岛素增敏药及抗糖尿病药物的胰腺外作用评价。
2、5 ob/ob小鼠：为2型糖尿病动物模型，属常染色体隐性遗传。纯合体动物表现为肥胖、高血糖及高胰岛素血症。症状的轻重取决于遗传背景，ob/ob小鼠与57BL/KsJ交配的子代症状严重，而ob/ob与C57BL/6J交配的子代症状则较轻，后者是杂合体。ob/ob小鼠leptin(ob基因产物)缺乏，引起肝脂肪生成和肝糖原异生，高血糖又刺激胰岛素分泌,引起胰岛素抵抗的恶性循环。该模型可用于口服降糖药尤其是胰岛素增敏药的评价。
2、6 db/db小鼠：db/db小鼠由C57BL/KsJ近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来，属2型糖尿病模型。其体型极胖。在一个月时开始贪食及发胖，继而产生高血糖、高血胰岛素，胰高血糖素也升高，一般在10个月内死亡。C57BL/6J db/db糖尿病小鼠发生严重的糖尿病症状类似C57BL/KsJ ob/ob小鼠，即早发的高胰岛素血症，体重下降和早死。db/db小鼠与ob/ob小鼠不同之处在于db/db可发生明显的肾病。
2、7 Zucker肥胖大鼠：是典型的高胰岛素血症肥胖模型，为单常染色体隐性基因（fa）所致，常发生于幼龄。动物有轻度糖耐量异常、高胰岛素血症和外周胰岛素抵抗，无酮症表现，类似人的非胰岛素依赖型糖尿病。该模型血糖水平终生正常。
2．8 自发性高血压/NIH肥胖大鼠（SHR/N-cp）：该模型为常染色体隐性遗传，该大鼠不能生育，以杂合子交配繁殖。该鼠为非胰岛素依赖性糖尿病动物模型，表现为：肥胖，轻度高血压，血清胰岛素升高，葡萄糖耐降低。
3、转基因糖尿病模型（Transgenic diabetes model）
    转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的生物高新技术，主要有两种方法：传统的转基因方法即新基因信息的转入和在动物体内的表达；基因打靶方法即将特定的内源性基因断裂或以其他基因代替。胰岛素信号转导是一个复杂的过程,若将胰岛素信号转导通路中的某个基因敲除,有望得到理想的糖尿病动物模型。随着分子生物学、基因技术的发展及其在科学领域中的应用，利用基因敲除技术复制糖尿病模型已取得突破性进展，目前有单基因敲除和多基因敲除两种方法，目前此种模型建立方法主要产生2型糖尿病症状，是2型糖尿病模型。
    GK/IRS-1双基因剔除小鼠：IRS/1-/-小鼠表现为胰岛素抵抗，但由于β细胞代偿性增生，胰岛素分泌增多，糖耐量正常。β细胞特异GK表达降低的小鼠，显示轻度糖耐量异常。两者杂交产生的GK/IRS-1双基因剔除小鼠，表现2型糖尿病症状，既有胰岛素抵抗又有糖耐量异常。
    IR+/-/IRS-1+/-双基因剔除杂合体小鼠：IR+/-和IRS-1+/-单个基因剔除的杂合体小鼠无明显的临床症状。而IR+/-/IRS-1+/-小鼠肝和肌肉中IR和IRS－1表达水平下降60%，由胰岛素介导的IR自动磷酸化，IRS－1和IRS－2的酪氨酸磷酸化，PI3－激酶的p85亚基与IRS－1的结合都减少。4～6月龄时，发生明显的胰岛素抵抗(表现为血胰岛素水平显著升高和对外源性胰岛素不敏感)，6月时，40%的杂合体双突变鼠表现糖尿病症状。
    IRS-2-/-小鼠：表现为胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足(不能引起β细胞代偿性增生,无法对抗胰岛素抵抗)，从而引发2型糖尿病。但IRS-2-/-小鼠单个β细胞胰岛素分泌正常甚至升高。
    此外，转基因动物模型还有MODY3模型，妊娠糖尿病模型如杂合体C57BL/KsJ-db/+小鼠等等。

参考文献
1. 杜冠华等译.药理学实验指南?新药发现与药理学评价（第一版）.北京.科学出版社.2001.698-712
2. 徐叔云等主编.药理实验方法学（第三版）.北京.人民卫生出版社.2001.1516-1522
3. 李聪然，游学甫，蒋建东.糖尿病动物模型及研究进展.中国比较医学杂志.2002，15（1）：59-63
4. 赵保胜，董淑云，霍海如等.2型糖尿病动物的研究进展.中国实验方剂学杂志.2005，11（5）：62-66