关于合成多肽中差向异构体杂质的研究

1963年，美国著名生物化学家Bruce Merrifield 发明了多肽固相合成法，经过四十多年的发展，固相合成法已广泛应用于多肽和蛋白质的研究领域。固相合成法的基本原理是以连接于固相载体的第一个氨基酸为起点，经活化、耦合、脱保护的循环过程，将保护氨基酸逐一“组装”形成目标肽，由于氨基酸多为手性分子（甘氨酸除外），在肽合成的过程中不可避免的存在消旋化的可能，这可能导致肽分子部分或全部立体化学信息的丢失。如一个10肽的合成中，每个氨基酸发生1％的差向异构化，则生成的非对映异构体混合物中只有90.4％的肽含有正确的立体构型。而对于一个50肽，理论上就只有60.5％为目标立体构型产物。由于肽类药物的生物活性与其立体构型密切相关，因此差向异构体杂质的研究是多肽药物有关物质研究的重要内容之一。

一、多肽合成中氨基酸差向异构化的机制

1、直接烯醇化机制

肽缩合过程中，在碱的作用下失去羧基α位质子，经烯醇式中间体发生消旋，消旋速率依赖于活化羧基α位质子的酸性、溶剂、温度及碱的化学性质。

2、5(4H)-噁唑酮机制

DL-肽 LL-肽

在氨基酸活化时，产生立体化学不稳定的5(4H)-噁唑酮中间体（D/L-4）是缩合反应中发生消旋的主要原因。形成噁唑酮的倾向与化合物1中活化基X的活化能力及N-酰基R1-CO-的电子特征密切相关。尽管有消旋化倾向，噁唑酮依然代表羧基活化的氨基酸衍生物应用于肽链合成中。反应中的消旋程度取决于噁唑酮的形成能力及其氨解速度。

二、差向异构体的控制及检查方法

1、差向异构体的过程控制

首先，应注意手性合成原料的控制。合成多肽中各手性中心直接来源于合成原料—各种保护氨基酸，因此应注意加强合成原料—保护氨基酸立体构型的控制，在内控质量标准中增加光学纯度的控制。由于比旋度方法专属性、灵敏度方面的限制，建议采用手性HPLC法控制起始原料的光学纯度，对于比旋度数值较小的保护氨基酸更应如此，如Fmoc-Glu(OtBu)-OH为+1.2o、Fmoc-Gln(Trt)-OH为-1.0o，比旋度法根本无法有效控制其光学纯度。

其次，应加强反应过程的控制。注意合成策略、氨基酸侧链保护基的选择，加强对偶联试剂、投料比、反应条件等的考察研究，尽量减少差向异构体的产生。例如，曾有申报单位对一个4肽片断的合成中His消旋情况进行研究，当Fmoc-His(Trt)-OH的投料量由4倍过量增加至8倍过量后，由于反应物浓度提高、反应速率加快，His的消旋程度大约下降一半。

2、多肽中差向异构体的检查方法

同其它合成药物的有关物质研究，合成多肽中差向异构体杂质也多采用HPLC法检查，最常用的是反相色谱系统，采用C18、C8或C4柱等。文献报道，齐崴等采用C18柱、水(0. 1% TFA)和乙腈( 0. 1% TFA)梯度洗脱的色谱系统可将H₂N-PFNSLAI-COOH合成中的差向异构体杂质良好分离，并通过液质联用对差向异构体杂质进行了初步确证。但随着肽链的增长，少数氨基酸消旋产生的差向异构体杂质在反相色谱系统下常常无法有效检出，建议可根据产品的性质考察其它不同原理的色谱系统，如离子交换色谱、凝胶或高分子多孔微球为填充剂的分子排阻色谱等。例如，某多肽药物（30肽以上）的研发早期，采用RP-HPLC法测定纯度为97.8%，而采用SCX-HPLC纯度仅 88.0%，其中His差向异构体杂质（RRT1.03）高达9.8%。

另有文献报道，将多肽全水解、衍生化生成非对映异构体后，再采用HPLC或GC的方法测定多肽中每一种氨基酸的消旋程度。由于多肽水解的过程中也会发生氨基酸的消旋化，因此需采用DCl进行水解，在水解过程中消旋化的氨基酸的羧基α位为D原子，通过HPLC-MS或GC-MS可有效排除水解过程中消旋化的干扰。

作为合成多肽有关物质研究的重要内容之一，建议申报单位加强对差向异构体杂质的研究和控制。以上仅为个人观点，不妥之处，请广大业内人士批评指正，并欢迎就此问题交流讨论。

参考文献：

1、刘克良，何军林等译. 肽：化学与生物学. 科学出版社.

2、齐崴，贾辰熙. 反相高效液相色谱与质谱联用分析合成七肽的消旋产物.分析化学 , 2006, (09)，1244～1248.

3、David R. Peptide chiral purity determination: hydrolysis in deuterated acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 707(1995)233-244.

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