生物等效性试验中几个需要关注的问题探讨

四部八室魏春敏赵建中

生物等效性评价是指同一种药物的不同制剂在相同实验条件下，?予相同的剂量，判断其吸收速度和程度有无显著差异的过程。
通常的生物等效性研究是以药代动力学参数为终点指标，根据预先确定的等效标准和限度进行的比较研究。如果两制剂含等量的相同活性成分，具有相同的剂型，符合同样的或可比较的质量标准，则只能认为他们是药学等效的，辅料和生产工艺的差异可能导致药物溶出或吸收行为的改变，从而造成治疗不等效，甚至导致安全性问题。通过测量不同时间点的生物样本中药物浓度，得到的药物浓度-时间曲线可反映药物从制剂中释放吸收到体循环的动态过程，由此计算得到AUC、Cmax、Tmax等参数，反应了药物活性成分进入体循环的程度和速度，因此生物等效性研究是证实两制剂治疗等效性最客观的办法。
由于生物等效性评价是从受试制剂和参比制剂药代动力学参数的样本均数推断总体均数是否等效，同时，生物样本存在取样量少、药物浓度低、干扰物质多及个体差异大等问题，因此，试验设计、生物样本测定方法及统计分析等诸多环节均能影响生物等效性研究结果，2005年3月发布的《化学药物制剂人体利用度和生物等效性研究指导原则》提出了生物等效性研究应遵循的基本原则，但具体试验过程中常会遇到一些难以把握的情况，现就生物等效性研究中的几个需要关注的问题予以分析探讨。
一、试验设计：
一般情况下，我国规定人体等效性试验可选择18～24例健康受试者，采用交叉设计的方法，对受试者例数，FDA和EMEA又有不同的要求，从表1可以看出，对于多数药物，18～24例即可满足80%的把握度要求，个体内变异大于30%的高变异药物则需增加样本量，采用重复交叉试验设计，提高把握度；长半衰期药物可采用平行试验设计，以缩短试验周期。
表1 平均生物等效性研究中不同变异度的样本含量估计
(两制剂的真实差值Δ=0.05)

80% Power
sWT sD 2P
0.15 0.01 12
0.10 14
0.15 16
0.23 0.01 24
0.10 26
0.15 30
0.30 0.01 40
0.10 42
0.15 44

注：σWT表示个体内变异；σD表示源于药物制剂和受试者间交互作用的变异；2P为2周期交叉试验；4P为4周期交叉试验；Power指统计检验的把握度。
二、等效界值的设定：
通常情况下，两制剂如生物等效，有：
ln(8/10)≤μT-μR≤ln(10/8)
即：
ln0.8≤μT-μR≤ln1.25

μT和μR为总体均数，一般用样本均数估计，即两样本均数的90%置信区间在(ln0.8，ln1.25)。通常情况下，AUC和Cmax呈正偏态分布且方差不齐，所以应对其先作对数转换，以改善其分布的偏性，缩小方差间的差异。以AUC为例，两制剂如生物等效则有：
ln0.8≤ln(AUCT)- ln(AUC R)≤ln1.25
即：
ln(0.8)≤ln(AUCT/AUC R)≤ln(1.25)
故通常规定受试制剂与参比制剂的AUC比值的90％置信区间落在80%～125%范围内，即判定两制剂生物等效。某研究结果显示试验制剂AUC落在参比制剂AUC的80%～125%范围内，因此判断两制剂等效，这种表达方式显然不对。
三、取样点的确定：
除考虑总时长应满足3～5个半衰期或Cmax的1/10～1/20外，还应注意取样点的分布，一个完整的血药浓度?时间曲线,应包括药物各时相的采样点, 一般在吸收相至少需要2～3 个采样点，峰浓度附近至少需要3 个采样点，消除相至少需要3～5个采样点，一般为13～15 个采样点。多次给药，可根据单剂量药代动力学求得的消除半衰期，估算新药可能达到稳态浓度的时间，连续测定3天的谷浓度（给药前）以确定达稳态浓度。当确定已达稳态浓度后，在最后一次给药后，采取一系列血样，包括各时相（同单次给药），以测定稳态血药浓度?时间曲线。
当以普通制剂为参比，进行缓控释制剂的AUC等效性研究时，若普通制剂与缓控释制剂每日给药次数不同，应做到两制剂日给药剂量相等，并使用各自的临床实际用法用量。例如：普通制剂临床推荐用药方法为每日2次，缓控释制剂每日1次给药，多次给药的等效性研究可按《指导原则》中的方法采样，即达稳态后，缓控释制剂选末次给药，参照单次给药采血时间点设计，普通制剂仍按2次给药的药时曲线确定采样点，测得AUC是实际2次给药后的总和，稳态峰浓度、达峰时及谷浓度可采用2次给药的平均值；当普通制剂临床推荐用药方法为每日3次，缓控释制剂每日2次给药时，应将缓控释制剂2次给药的AUC和普通制剂3次给药的AUC进行比较，采血时间点需足够密集以体现两制剂各服药间隔吸收、分布、消除相的全过程。

四、样本分析：
生物等效性研究中的生物样本一般为全血、血清、血浆或尿液，以血浆和血清最为常用，定量分析前需进行去蛋白或纯化、萃取、浓缩处理。常用处理方法有直接沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法等，需进行严格的方法学验证，确保符合生物样品检测要求。
（一）最低定量限（LLOQ）：由于生物样本中药物浓度较低，而且生物样本多种内源性物质可能对其测定产生干扰，FDA规定，应以空白背景响应值的5倍作为估计值，即S/N≥5，且其准确度在80%～120%，RSD小于20%为LLOQ。若S/N≥3，仅可作为定性，即为最低检测限，不足以用于定量，应进一步优化分析方法。
（二）绝对回收率：生物样本中加入标准品提取后得到的响应值除以相应浓度标准品溶液的响应值即为绝对回收率，又叫提取回收率，与相对回收率不同，绝对回收率是将待测物从生物样本中提取出来供分析的比例，一般要求在50%～80%范围内，低、中、高浓度的绝对回收率应精密并具有可重现性，如三种浓度绝对回收率相差较大，则应对提取方法各环节进一步考察优化。
（三）标准曲线：对生物样本中药物进行定量分析需采用标准曲线法进行回归运算，而生物样本中药物浓度范围往往较宽，以往采用的最小二乘法的原理是使得待测物响应值与标准曲线相应估计值差值的平方和最小，即标准曲线上各浓度点绝对误差同等重要，假设拟合的标准曲线r=0.999，低浓度点和高浓度点的绝对误差相同，此时，高浓度点的相对误差可能不超过15%,而低浓度点的相对误差可能已远远大于15%。加权最小二乘法是在回归计算时，加入与绝对误差成反比的权重因子，即将大的权重赋于绝对误差小的点，而小的权重赋于绝对误差大的点，以使生物样本各浓度点的测定值与真实值的相对偏差比较均衡。所以，目前生物样本测定常采用加权最小二乘法进行回归运算。
（四）样本的稳定性：药物在生物样本中的稳定性取决于药物本身的化学性质、生物样本的种类、样本存放条件以及容器的性质。一般情况下，需进行至少三样本低、高浓度稳定性试验：
1. 冻融稳定性：生物样本冷冻24小时后，室温自然融化进行测定，再将样本冷冻12-24小时后，同样条件进行测定，应经过3次冻融循环，样本冷冻温度应与生物等效性试验中样本实际存放温度一致。
2. 短期室温稳定性：生物样本室温放置4-24 h内稳定性试验。
3. 长期稳定性：考察时间的长短取决于生物等效性研究中完成所有样本分析的总时间。
4. 储备液稳定性：应考察储备液或内标溶液室温6小时稳定性，如需冷藏或冷冻放置，应与新配制的储备液或内标溶液相比较。
5. 处理后稳定性：应考察生物样本处理后，放置于自动进样器待分析条件下的稳定性，考察时间取决于样本分析周期和分析批的样本数。
（五）液-质联用分析中的方法学考察：随着药物药理活性的不断增强，给药剂量日益减小，生物样本中药物浓度越来越低，液-质联用在生物等效性研究中的应用也日益广泛。应用液-质联用仪进行生物样本分析，大大提高了检测灵敏度高，简化了样本前处理过程，缩短了分析周期，但生物样本中的内源性物质常常会对待测组分产生离子抑制，所以，除应进行通常的方法学考察外，还应进行空白基质效应研究。具体方法为提取后空白样本进样的同时，柱后持续灌注一定浓度标准溶液，如在待测物峰位置的响应降低，则证明有空白基质效应存在，将标准溶液加入提取后空白样本中进样测得的峰面积和相应浓度标准溶液的峰面积之比即为离子抑制效率。
以上仅就审评过程中遇到的生物等效性试验中常见问题进行分析探讨，并未涉及生物等效性研究的全部内容，旨在为研究者提供参考。

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