体内微核试验的自动化分析_摩熵医药(原药融云)

遗传毒性评价是新药非临床安全评价的重要组成部分，采用标准试验组合的方式。由于体内试验具有考虑到了与人体应用相关的吸收、分布、排泄、代谢的优点，体内试验在遗传毒性评价策略中意义重大。啮齿类动物体内微核试验由于其检测终点明确、重复性好且易于开展，是目前广泛应用的体内遗传毒性检测方法，是ICH指导原则中规定的药物遗传毒性标准试验组合中唯一一项体内试验，也是我国药物遗传毒性研究指导原则所规定的一项试验。
目前，体内微核试验采用人工显微镜阅片的方法。该方法虽然程序简单，但存在一些明显的缺陷。首先，人工阅片时间长，费时费力，工作效率较为低下。其次，人工阅片的准确性依赖于检测人员的水平，而在目前需大量进行该试验的情况下，检测人员水平不一，将导致检测结果具有很大的主观性。最为重要的是，微核的发生率低，在一组动物上能否检出小的微核升高率的能力受到计数误差以及动物个体之间差异性的限制，而且，在单个动物上能否检测出小的微核升高率的灵敏度受到低微核数的计数误差以及在检测过程中个体动物高的自发变异性的限制。基于这种实际，ICH的国际遗传毒性试验工作组（the International Workshop on GenotoxicityTesting，IWGT）建议，应尽可能计数足够数量的细胞，以使计数误差低于动物间微核率的变异性^[1]。也就是说，为了达到充分的检测灵敏度，只有检测大量细胞才能保证检出微核。虽然2007年颁布的《药物遗传毒性研究指导原则》已将检测细胞数由原来的1000个嗜多染红细胞提高为至少2000个，但是仍难以解决灵敏度的问题。因此，目前需大量检测化合物与相对较慢速度的微核人工检测方法之间、待检任务和检测能力之间的矛盾变得比较突出，需要以新技术、新方法来提高体内微核试验的检测能力。
近年来，IWGT一直努力推进微核试验的自动化检测技术的发展和应用。自动化检测技术的研究主要集中在流式细胞术（flow cytometry，FCM）上。 FCM是微核试验自动化检测研究的最初尝试，经过近20年的发展，FCM已经成为微核自动化检测的一个重要方向，并且不断成熟。
在1999年举行的第二次IWGT会上讨论的议题包括了微核自动化技术的应用。在这次会上，IWGT根据OECD提出的一般原则，提出微核自动化计数系统应符合如下具体标准：（1）需证明自动化检测结果与人工显微镜计数结果（未成熟红细胞中的微核率、成熟红细胞中的微核率和未成熟红细胞占所有红细胞的比例3个指标）一致；（2）无论是染色体碎片还是整条染色体丢失所致的微核，自动化检测系统都得检测出；（3）自动化计数重复性好，能保持实验室内部和不同实验室之间的结果的稳定性；（4）实验室应建立如何辨别一些已知的干扰物（血小板、嗜碱性颗粒、海因茨小体和RNA聚集体等）的方法^[2]。
在2005年举行的第四次IWGT会上再次讨论了这个问题。由于因为流式细胞术较其他方法（如图像分析）具有明显的优势，因此该次会重点讨论了流式细胞术。工作组一致同意，基于现有的资料，流式细胞术检测诱导微核化的未成熟细胞红细胞具有诸多优点^[3]。在这种情况下，将自动化检测方法纳入了ICH指导原则中，2008年发布的ICH S2（R1）人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则（Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use提出：如果已被验证适合，可采用自动化分析系统（图像分析和流式细胞仪技术）对微核进行检测^[4]。
FCM自动化检测微核技术经过不断的技术优化和改进，方法学不断成熟，已经基本达到IWGT要求，并有望成为国际管理机构认可的常规显微镜检微核的替代方法。流式细胞术具有以下优点：（1）与人工计数相比重现性好、灵敏度高。由于其检测能力高，可检测高达20000个RET（网织红细胞）或PET（嗜多染红细胞）中的微核，使得微核检出率大大提高，克服了人工计数由于受计数细胞所限导致的灵敏度低的缺陷。（2）测定快速，能分析大量细胞，效率远远高于人工计数，能符合目前新药研究高通量筛选的要求。（3）可采用外周血进行微核分析，且仅需少量外周血，可进行多次给药不同时间点的微核水平检测。由于大鼠脾脏有一定的代谢清除血中含微核红细胞的能力，常规认为体内微核试验（尤其是检测外周血中微核时）避免使用大鼠。现有研究提示，采用流式细胞术检测外周血具有较高的灵敏度，且外周血中的微核与骨髓中的微核呈明显相关性，这使得大鼠外周血网织红细胞微核分析成为一种可行的微核分析方法。由于流式细胞术的应用，使得体内微核试验具有整合入一般毒理试验（如重复给药毒性试验）的可能，而无需单独进行微核试验，进而可减少动物数的使用，符合动物实验的3R（减少、替代、优化）原则。
但是，另一方面，虽然流式细胞术具有以上诸多优点，与人工显微镜阅片计数相比，存在一定的技术难度，如处理过程较为复杂、方法学要求较高，需要有一定技术基础的实验室才能保证方法学的可靠性。
目前，微核试验的流式细胞术在我国安全性评价中尚未广泛开展，采用的仍是人工显微镜阅片方式。但我们高兴地看到，一些药物安全性评价中心对FCM在微核试验中的应用进行了深入的研究^[5]，为这种灵敏、快速高效的自动化检测方法在中国的研究与应用奠定了基础，值得对该方法进行更为深入的研究和验证，进一步评价其在国内广泛推广使用的可行性。

参考文献：
1. Kissling G E, Dertinger SD, Hayashi M, et al. Sensitivity of the erythrocyte micronucleus assay: Dependence on number of cells scored and inter-animal variability[J].Mutation Research , 2007,634: 235-240.
2. Hayashi M, MacGregor JT, Gatehouse DG, et al. In vivo erythrocyte micronucleus assay Ⅱ. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring [J]. Environ Mol Mutagen, 2000, 35(3): 234-252.
3. Hayashi M, MacGregor JT, Gatehouse DG, et al. In vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test [J]. Mutat Res, 2007, 627(1): 10-30.
4. International Conference on Harmonization. Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2 (R1) [EB/OL]. https://yaorongyun-enterprise-data.oss-cn-shanghai.aliyuncs.com/policies/document/4a6664ac3cb9976113595469a2c89ed8.pdf, 2008-03-06.
5. 周长慧, 王征, 王庆利, 等. 基于三色流式细胞术的小鼠外周血微核试验方法的建立[J].癌变畸变突变, 2011, 23(2): 128-133.

体内微核试验的自动化分析

最新政策法规资讯

最新其他政策

同部门最新其他政策