多肽药物有关物质方法开发_摩熵医药(原药融云)

多肽药物有关物质方法开发

多肽药物

药事纵横

2023/06/16

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多肽药物作为分子量介于小分子化学药物和生物大分子之间的药物类型，为药物化学家提供了更多的选择，近些年来也成为研究热点。本文针对多肽药物有关物质（肽相关杂质1）分析方法开发进行探讨。

多肽分子是由多个氨基酸通过肽键（酰胺键）连接而形成的化合物，其有以下几个特点：

多肽药物分子量较大，如多肽类明星药物索马鲁肽（司美格鲁肽）分子量为4114Da，虽低于大分子药物，但分子量是小分子药物的数倍。分子量的增加使其在色谱行为上有了一些重要的变化，如其对溶剂强度更加敏感，B%的微小变化会引起保留时间的快速变化，另外其在流动相中的扩散也更慢，会导致柱效的降低和峰宽的增加2；

多肽分子存在高级结构。多肽链通过α螺旋和β折叠等方式形成二级结构和三级结构，有其特殊的三维结构形式。由于分子体积和三维结构，使得所有的氨基酸不会同时接触固定相，只有位于表面的残基才可以产生相互作用；

多肽分子通过酰胺键相连，酰胺键有部分双键性质，互变的顺反异构体可能会使峰型变差；

多肽分子为两性分子，具备酸性基团羧基和碱性基团氨基，有其特定的等电点。

多肽药物杂质谱十分复杂，如CDE发布的《合成多肽药物药学研究技术指导原则》（以下简称指导原则）中提到的，合成多肽分子有多种类型的工艺杂质和降解杂质，特别是差相肽杂质的结构和性质与主成分非常接近，色谱行为也相近，大大增加了分离分析的难度。

针对多肽分子上述特点，其在有关物质分析方法开发上也有一些特殊之处。多肽药物有关物质分析的常用方法是高效液相色谱法，可采用反相色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱等模式。

1.反相色谱法（RP）：

1.1色谱柱的选择：上文中提到的多肽分子在流动相中扩散慢的特点，在色谱柱选择时需要找着重考虑。

硅胶载体机械强度高，技术成熟稳定，可选择性高；

由于多肽分子缓慢扩散的特点，在表面多孔型硅胶颗粒上，溶质分子只进入颗粒表面的硅胶层，在颗粒中走过的路径更短，减少了颗粒内部扩散，因此在该类型颗粒上引起的谱带展宽更小，见图1。小粒径色谱柱也有助于解决谱带展宽和柱效降低的问题，虽然粒径越小，柱压会大大提高，但多肽分子在粒径减小上的收益要高于小分子化合物。同样，选择窄径柱也减少在色谱柱纵向扩散时的谱带展宽。

图13，全多孔与表面多孔颗粒传质路径对比

常见的10nm，12nm孔径的色谱柱可以满足大多数多肽的分析，允许多肽分子进入颗粒内部孔隙。

烷基键合相，特别是C18是目前最常用的固定相类型，同样用于多肽药物的分析，但各种类型的苯基柱可提供不同的选择性，特别是对含有酪氨酸等芳香结构残基的多肽。另外一些表面修饰，封端/不封端，嵌合基团的色谱柱也可提供不同的选择性。

目前市场上有诸多厂家，不同工艺和类型的反相色谱柱，品类繁多，而在方法探索阶段需要尝试不同选择性的色谱柱，可借鉴一些表征方法，如使用H、S、A、B、C参数的Snyder/Dolan法，或通过USP或供应商网站查找选择性差异大的色谱柱；另外使用自动化、智能的方法开发软件可大大节约开发时间，更适用于多肽有关物质方法开发。

1.2流动相的选择：

三氟乙酸是多肽分析时常用的缓冲液，有良好的缓冲能力，且和多肽的氨基形成离子对作用，增加保留，常用浓度为0.1%（V/V）；

磷酸盐是最常用的反相色谱缓冲盐，可以配置成不同的pH，高浓度的磷酸盐如50mmol/L可以提供较高的离子强度，减轻因多肽分子相互排斥造成的峰型展宽；离液剂如六氟磷酸盐和高氯酸钠等，不仅可以提高离子强度，改变选择性，且在乙腈水中的溶解度更高。

多肽做为两性物质，流动相pH的变化对分离有深远的影响，因此pH的筛选非常重要；需要注意的是多肽分子在等电点附近溶解度最低，应避开等电点pH至少±1.0个单位。

乙腈作为有机相（B%）有其明显的优点，紫外吸收低，粘度低，峰型优于醇类溶剂等。醇类溶剂（甲醇、异丙醇），可以少量加入提供不同的选择性；

前文中提到多肽分子对有机相B%敏感，微量变化可以导致保留时间明显改变，因此需要设置梯度程序时需缓慢增加B%，达到最佳分离；

1.3其他色谱参数：

高柱温降低流动相粘度，提高分子扩散速度，改善峰型，以及选择性的变化，提高分离度，还能解决顺反互变异构峰型差的问题，这也是多肽分析的一个特点，如图2的案例。需要注意的是如果使用高柱温需要对柱前流动相进行预热2，高柱温也有一些缺点，如样品降解和色谱柱寿命下降。

图22柱温对多肽分子分离度的影响

多肽缺少共轭结构，一般选择末端吸收波长210nm~220nm，即酰胺键的吸收；虽然有些多肽含苯丙氨酸等芳环侧链的氨基酸，但吸收强度明显低于末端吸收。

保证稀释液的pH和溶剂强度与初始流动相相同或接近，避免产生溶剂效应；

超高效液相色谱仪是多肽药物分析的首选，部分高效液相也可能满足性能要求。

2.离子交换色谱法（IEC）：由于多肽药物有丰富的杂质谱，很多时候仅仅使用反相色谱无法满足杂质分析研究的目的，离子交换色谱法提供了不同的分离选择性，可以作为反相色谱法的有效补充。

2.1流动相的选择：

缓冲液调控流动相pH，进而改变样品的电离程度，影响保留和选择性。对于多肽药物，流动相pH一般至少控制在等电点±1个pH单位。阳离子交换流动相pH至少低于等电点1个pH单位；阴离子交换，流动相pH至少高于等电点1个pH单位；缓冲液可选用反相色谱的常见种类，但磷酸盐仍是首选。
反离子在IEC中发挥着重要作用，其种类和浓度用于调控保留和选择性；阴离子：Cl-等卤负离子、ClO4-、SO42-；阳离子：Na+等碱金属离子；如果具备流动相选择的软件，则省时省力。
有机溶液：乙腈仍是首选，影响峰型和选择性；

2.2色谱柱的选择：

载体可选择硅胶，但要保证pH的耐受性，许多色谱柱厂家也提供聚合物载体；规格参考反相色谱法的建议；
IEC固定相一般有以下四种：强阴离子交换-N(CH3)3+；强阳离子交换-SO3-；弱阴离子交换：-NH2；弱阳离子交换：-COOH；

2.3其它色谱参数：可参考反相色谱。

3.尺寸排阻色谱法（SEC）：常用于多肽药物中聚合物杂质的分离，根据聚合物分子与药物分子体积的不同进行分离。

3.1色谱柱：填料选择硅胶表面采用硅烷醇（二醇基柱）修饰，以降低硅胶与多肽分子的作用。一般厂家推出的12nm孔径SEC柱可满足多肽聚合物的分离。色谱柱规格没有反相色谱柱多，可选较较小粒径。

3.2流动相：

缓冲液：可选常用的三氟乙酸、磷酸缓冲液，调控pH和离子强度减少离子化作用，根据需要可使用较高浓度；
有机溶剂：乙腈或甲醇，减少疏水作用；
流速：常用1ml/min，但由于多肽分子扩散系数低，可用较低流速以提高柱效。

小结

多肽药物有关物质分析方法开发难度大，周期长。正如指导原则中所述，需要摸索多种分离模式，以及每个模式下的各种参数，如不同固定相的色谱柱，不同流动相pH等等，随着杂质研究工作的推进还需不断优化各个参数。基于以上特点，多肽药物有关物质方法开发是一个系统性，技术性的高难度工作，需要方法开发人员不断学习，在实践中加深对分子特性和分离原理的了解，最后还要保持足够的耐心和信心。