关于色谱柱选择的几点思考

引言：虽然国内药品行业已有几十年的发展，关于各种技术、设备、物料与耗材等的研究遍地开花，而关于分析领域常用的重要耗材—色谱柱的研究却寥寥无几。本人在该邻域工作近十年，根据自己对色谱柱的经验及认识进行了归纳总结，希望能对同行有所帮助。

在分析方法开发过程中，主要考虑的内容包括色谱柱、流动相pH、流动相中有机相种类与柱温，其他需要考虑的还有盐浓度、流速、气相中分流比、溶液配制、计算方式等等。而根据分离度公式可知，色谱柱对于分离效果的影响是最大的。因此，在分析方法开发初期及整个生命周期中色谱柱的选择都是至关重要的。

色谱柱的应用范围很广，而本文主要探讨化药中常用液相色谱柱（主要是反相色谱柱）的选择。并从各种色谱柱的物理特性、键合相与分离机制及常见类型化合物分离的色谱柱选择三个方面展开阐述。

在拿到一根色谱柱后，我们需要了解到的信息是：型号、柱长、直径、粒径与孔径。其中色谱柱型号是由分离目的决定的，其选择下文将从硅胶填料与键合相方面进行展开；而色谱柱孔径对于化药小分子（分子量＜3000)化合物的分离影响较小，通常选择100A（硅胶空隙直径10nm）或者80A即可。

色谱柱柱长通常有250mm、150mm、100mm与50mm四种规格。对于原料药早期的有关物质分析方法开发建议选择250mm或150mm，以呈现尽可能多的杂质信息。而对于制剂的溶出度/溶出曲线分析方法用色谱柱，建议选择50mm或相当规格的色谱柱，以实现快速高效的检测。而色谱柱直径，为配合流速选择的方便性，市面的色谱柱通常是4.6mm、3.0mm与2.1mm三种，且色谱柱直径通常与其长度相关联。因此，在做色谱柱选择时，二者中仅考虑色谱柱长度。

色谱柱粒径是对色谱柱的分离效果影响较大的一个规格参数。市面上的色谱柱常规粒径有5um、3.5um、2.7um与1.8um等，通常选择的色谱柱粒径越小，分离效果越好，当然同时柱压也会增大，对液相系统的要求也不一样，需要更加分离目的与仪器可耐受范围进行合理选择。

而通常色谱柱柱的柱长、直径与粒径三个规格参数是关联在一起的，需要同步考虑。常规选择有：4.6 x 250mm 5um，4.6 x 150mm 5um/3.5um/3um，4.6 x 100mm 2.7um，3.0 x 100mm 2.7um，2.1 x 50 mm 4um/3.5um/3um/2.7um。

关于色谱柱的物理参数，还包括需要查询才能获得的信息，包括比表面积、碳载量、柱容量等。其选择需要根据带分离物特点进行考虑。如待分离化合物疏水性均较高，疏水性差异较小，且只能通过疏水性差异进行分离的情况下考虑采用高碳载量（常规C18柱碳载量10%∽15%）色谱柱，如Agilent pursuit XRs C18（碳载量23.2%）

目前市场上的色谱柱主要是B类硅胶，纯度较高，有较低的金属离子残留，且大多为全多孔。而新的实心核硅胶即近几年各大生产商热推的核壳柱也是一种选择。据个人经验，在方法开发初期推荐使用全多孔硅胶填料，因其可选择范围更广。而在方法开发后期，在各化合物分离风险不大的情况下（如最小分离度2.0以上）可以考虑用核壳柱。当然，如果在方法开发初期，根据化合物结构特点或者有可参考文献判断分离风险不大也可以尝试核壳柱。

另外，硅胶表面残留硅醇基的封端技术也减弱了硅醇基与碱性化合物作用带来的色谱峰拖尾现象，而目前大部分常规C18/C8色谱柱均采用了硅羟基封端技术。

另一个改善硅胶性能的技术是硅胶杂化（杂化颗粒）。如waters BEH系列色谱柱，其由两个高纯单体间的缩聚反应（四乙氧基硅烷和双（三乙氧基硅基）乙烷）形成Si-C-C-Si形式的亚乙基桥，使得要从亚乙基桥杂化颗粒中完全释放出一个亚乙基桥单位必须打断多达6个硅氧键，其他厂家如Agilent Extend系列色谱柱也采用类似技术（双齿键合），提高了色谱柱对高pH的耐受性。

液相色谱柱型号中包含的另一个重要信息为键合相类型。常规键合相包括，ODS（C4、C8、C18）、氨基、氰基、苯基、活化硅胶、离子交换及在ODS基础上发展出的极性嵌合及混合模式色谱柱。另外，按照键合方式分类，又分为单官能团键合、双官能团键合与三官能团键合。键合相种类和键合方式的不同为色谱柱提供了不同的分离选择性与稳定性，带来待分离物与色谱柱的不同作用方式。

待分离物与色谱柱的作用方式包括疏水性、立体选择性（位阻排除）、氢键、离子交换、偶极-偶极作用、Π-Π作用及螯合作用。

对于常规C18色谱柱来说分离机制主要是疏水作用，而不同品牌C18柱分离效果略有差异，其差异源于硅胶颗粒性质、装填工艺、残留硅羟基水平与碳载量等。嵌合型（极性嵌入与混合模式）色谱柱除疏水性作用外，还有氢键、离子交换作用，而这两种作用均来自嵌入的极性基团或阴/阳离子，为色谱柱带来了不同的选择性。HILIC模式的作用机制主要是亲水作用、离子交换与氢键作用，可作为常规C18色谱柱的补充。另外氰基柱、氨基柱、苯基柱分别以偶极-偶极作用、氢键作用、Π-Π作用及立体选择性实现不同的分离目的。

在化药仿制药的研发过程中，通常为分析工作者带来调整的是合成中间体及异构体的分离。

合成中间体通常为极性小分子，而且大部分活性较高，较不稳定。这类极性小分子一般采用常规C18难实现，需采用嵌合色谱柱、HILIC模式色谱柱、离子对反相以及离子交换色谱柱。

部分极性化合物（logP为正数或不低于2）可以在采用高水相条件下使用耐水的色谱柱以获得极性化合物的保留。这类色谱柱包括大孔径、低键合密度的waters T3柱，极性嵌入的Agilent SB-AQ柱等。这类色谱柱随能对部分极性化合物有一定保留，且兼容MS，但色谱柱耐受性不如常规C18柱。

而对于强极性的化合物（logP为负数），可采用HILIC模式色谱柱。对于酸性强极性化合物可考虑采用酰胺嵌合的HILIC柱（如waters XBridge Amide）；而对于强碱性极性化合物可采用纯硅胶及含多羟基键合的HILIC柱（如Agilent HILIC-OH5,环果聚糖键合）；当带分离化合物包含酸性、碱性和/或两性离子时，采用两性离子嵌合色谱柱（如Agilent HILIC-Z）是一个不错的选择。然而这类色谱柱有一个共性的问题是重现性不佳。因此，在分析方法开发早期建议采用新色谱柱（本人接触的案例中就出现方法开发时用旧色谱柱分离效果不错，而方法转移采用新色谱柱重现不了的情况），同时考虑硅胶耐受性（如杂化颗粒）。另外，还需要考虑色谱柱的耐受空间，用于大量样品检测的分析方法边界远离色谱柱的可耐受边界。同时，在色谱柱清洗时需要尽可能将色谱柱中残留的极性化合物或离子（可能来自流动相）清洗干净，并专柱专用，提供方法的重现性与色谱柱耐用性。

当化合物需要通过立体差异（如异构体）进行分离时，常规的做法是采用正相色谱柱或者采用苯基柱子。但是在极性化合物或者液体制剂需要考察异构体时仍采用上述色谱柱将出现溶解性或兼容性问题。此时可考虑采用反相多糖衍生物涂敷型手性色谱柱（如大赛路的RH系列，YMC的Amylose-C与Cellose-C以及菲罗门的手性RH系列。

另外，在进行色谱柱对比（或者色谱柱替换）时可参考waters官网的色谱柱选择工具(https://find.waters.com/ColumnCoach/existingcolumn/column)或者ACD-Lab软件中色谱柱选择模块进行色谱柱分离性能及相似度进行评估。

在分析方法开发初期，在对于分析方法目的以及待分离物特性有了一定了解后，需要分析工作者根据自己的认识选择合适的方法开发策略。在选择了色谱柱后，接下来重要的工作就是选择合适的流动相。因为流动相的选择不仅决定了其洗脱能力，还影响待分离的溶解性、离子状态、流动相与化合物及化合物与固定相的作用力。而通常解决方案不止一个，因此需要从分析方法的风险、检测目的、分析方法的生命周期等诸多方面进行综合考虑。

近几年行业发展迅速，各类新的分析技术、新的色谱柱不断涌现。而仿制药的研发面临诸多压力，不管是作为药企还是从业者都需要根据时代需要，在及时跟进新技术并更新知识体系的同时根据自身情况选择合适的方向，才能在行业中贡献独特的价值并获得长远发展。

注：关于色谱柱的内容是本人根据已有工作经验及对各厂家色谱柱学习所得。如有描述不当之处欢迎同行批评指正。

相关阅读：

色谱柱选择指南-固定相的键合方式及修饰、