一文搞定有关物质方法中校正因子和相对响应值因子

校正因子相对响应值因子色谱

药事纵横

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1. 背景介绍

在药物有关物质分析过程中，计算结果时会经常遇到使用校正因子（Correction Factor , CF）或者相对响应值因子（Relative Response Factor, RRF）的情况，但有些分析员对CF和RRF的来源和应用还存有疑惑，本文将对CF和RRF的来源和应用进行详细的阐述，本文仅代表个人观点，如有不足之处，还请各位同仁指正。

2. CF和RRF的来源

高效液相色谱法定量的原则是在一定浓度范围内，物质的浓度或量与物质响应值呈一定的相关性。以物质浓度为横坐标，物质响应值为纵坐标，绘制标准曲线，见线性图图1和线性数据表1。

表1 线性数据

图1 线性图

从表1中，可以得出结论物质响应值/物质浓度可以近似为一个恒定的值，从图1中可以得出以该物质与物质响应值绘制的标准曲线相关系数为1.0000，因此该物质浓度在1-8μg/ml范围内，与物质响应值呈线性相关。根据上述的结论可以推导出，如果我们有该物质的标准品，即含量已知，那么在浓度1-8μg/ml范围内，就可以按照下面公式计算待测物质的样品含量：

Astd表示该物质标准品的响应值；Cstd 表示该物质标准品的浓度；Aspl 表示待测物质的响应值；获得以上3个数值后，我们就可以计算Cspl，即待测物质的浓度。该计算方法，在测定一种物质的含量时需要使用同一物质的标准品，被称作为外标法定量方式。在有关物质中，也会采用外标法定量。但由于有关物质标准品的可及性以及经济性问题，有关物质的标准品获取具有一定的局限性。这时便引入了校正因子和相对响应值因子。

从图1和表1中可以知道一种相同物质在一定浓度范围内，物质的浓度或量与物质响应值呈一定的相关性。但因为不同物质之间结构存在差异，所以在HPLC分析中，即使不同物质的量相同，响应值也存在一定的差异。但这种差异也存在一定的相关性，即CF和RRF。以主成分和杂质的线性数据建立标准曲线，见表2和图2。主成分的标准曲线方程为y=10010.7073x-70.1707，杂质的标准曲线方程为y=15102.9329x-186.5183，在检验操作误差和仪器误差可控且较小的情况下，截距可以忽略，所以两个方程可以，近似为y=10010.7073x和y=15102.9329x，方程中的斜率即响应值/浓度和表2中的结果进本一致。所以在浓度相同的情况下可以得出：

将该公式引入有关物质计算公式中即可进行相关杂质的计算，校正因子为主成分斜率/杂质斜率，计算时需要放在计算公式的分子部分，将杂质峰面积折算为主成分峰面积。而相对响应值因子为杂质斜率/主成分斜率，计算时需要放在计算公式的分母部分，将主成分的峰面积折算为杂质峰面积。

表2 主成分和杂质线性数据表

图2 主成分和杂质线性图

校正因子和相对响应值因子互为倒数，欧洲药典和中国药典中通常使用校正因子，美国药典通常使用相对响应值因子。其欧洲药典和中国药典通常采用带校正因子的主成分自身对照法，即对照溶液由供试品溶液稀释制得，定量时需要每份供试品溶液稀释制得自身对照溶液，而美国药典采用的是带相对响应值因子的主成分外标法，即对照溶液由标准品制备而得，在计算过程中需要对质量进行折算，详见表3内容。

表3带校正因子主成分自身对照法和带相对响应值因子主成分外标法比较表

3. CF和RRF的应用注意事项

CF和RRF的测定，应当覆盖方法的应用范围，一般从定量限（LOQ）水平开始，至限度水平的120%，建议可以将上限提高一些，使方法应用时可以更加灵活。CF和RRF为0.9-1.1之间时，可不再进行校正，此为药典要求，但在实际操作过程中建议采用实际值进行折算，避免出现所得结果在限度边缘出现超标的尴尬情况。药典中给定的CF和RRF通常为一位小数，对定量结果影响较大，因此建议采用保留两位小数进行校正。如果超过0.2-5.0范围时，说明两种物质响应值差异较大，此时定量的误差较大，建议采用杂质外标法进行定量。

除杂质外标法外，还有一种另外方式和大家分享下，某一项目有关物质为双波长方法，主成分和杂质A以及未知杂质均在波长A下测定，但杂质B在波长A下响应值较低，所以在波长B下测定并采用波长B下的主成分进行定量，方法源于USP，但在波长B下RRF值远远大于5.0，虽然是USP方法，但也是审评老师质疑了定量的准确性问题。后参考BP方法，在波长B在测试杂质B，使用波长A下的主成分，计算杂质B的含量，这样RRF既可落在0.2-5.0之间，并被审评老师所接受，见图3。

图3 杂质B定量方式的修订

在CF和RRF计算过程中，应当对标准品的纯度和盐基进行折算，以保证所得因子的准确性，此处非常非常关键，经常容易被忽略，望引起各位的重视。此外，各国药典方法中有时也会给定CF和RRF，测定时应与药典给定值进行比对，如果差异过大，因进行分析，是否杂质对照品不稳定或吸潮等，笔者在实际实验中确确实实遇到了类似的问题，如果杂质对照品不稳定或吸潮，应尽可能压缩采购周期，并限定好运输条件，到货后立即测定。CF和RRF通常只针对已知杂质，对于未知杂质，则不再进行校正。

4. 结论

鉴于当前审评尺度，有关物质方法中控制的杂质个数非常多，所以CF和RRF的应用越来越为广泛，CF和RRF会直接参与到杂质的结果计算，所以非常重要，为保证检测结果的有效性和准确性，对CF和RRF的研究一定小心并且要透彻，建议在实验室内部尽可能的考虑多因素进行测定，如不同仪器，不同人员，以便项目可以顺利申报注册，如果前期的研究工作不够彻底，从方法开发，验证，放行检测再到稳定性数据都会可能受到影响。最后，希望本文对您有所帮助！

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