皓阳生物基于可商业化授权的CHO-K1细胞株，结合自有的质粒系统以及细胞株筛选方案，建立皓越®稳定细胞株平台，2021年至今已为国内外客户完成超过50个单抗、双抗以及融合蛋白稳定细胞株构建项目。在常规培养条件下，项目平均表达量大于6.7g/L，高效助力客户项目更快更好推进。2022年，基于皓越®的基础上进一步打造Fut8敲除的ADCC加强型稳定细胞株构建平台，为客户提供更多元的选择与服务。皓越®以成为全球稳定细胞株构建的第一品牌为愿景，帮助客户赢在CMC起点，坚持精益求精的品质，为每一位客户聚力，为每一个项目赋能。
现在，皓阳正式推出“4g保底，挑战无上限”的稳定细胞株开发服务！为对称结构的单/双抗提供4g/L的保底细胞株构建服务。为实现全球稳定细胞株构建第一品牌的愿景，欢迎客户将皓阳的服务同步与国内外任何同行做同步对比。
双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）是一类能识别两种位点或能与两种抗原进行结合的非天然抗体结构，从由linker连接的两个最小抗原结合片段，到IgG结构基础上交联额外的结构域的“大型”分子，科学家们的奇妙构思造就了琳琅满目的精巧架构，赋予了理论上“1+1大于2”的能力——bsAb能表现出单独的亲本抗体或混合的“鸡尾酒疗法”不可比拟的性质和潜力。如在最为广泛的应用领域之一——肿瘤的免疫治疗上，bsAb能同时结合两个位点，发挥阻断肿瘤细胞信号通路，介导免疫细胞杀伤靶细胞等功能，降低单抗的“脱靶”效应，减少肿瘤细胞逃逸。由于bsAb的种种优越性，近年来一直受到业内的高度关注，也成为癌症，炎症，自身免疫病等多种疾病的开发热点。
随着行业发展，从第一个上市的Catumaxomab起，Amgen的Blinatumomab和Roche的Emicizumab相继获批，近期国家药品监督管理局（NMPA）官网公示，由康方生物自主研发的PD-1/CTLA-4 双特异性抗体Candonilimab获批上市。可以预见，未来的赛道上涌现的bsAb明星将会越来越多，而将一个promising的bsAb从实验室推动到临床及上市，真正造福患者，从CMC的角度，需要高屋建瓴的设计与思考。
通过剖析与归纳bsAb的结构，可分为具备Fc区的IgG-like bsAb及不具备Fc区的non-IgG-like bsAb，其中IgG-like bsAb又分为对称（Symmetric）和非对称结构（Asymmetric）。Catumaxomab和Emicizumab是IgG-like bsAb的典型代表，这类bsAb在CMC上的优势在于溶解性和稳定性较好，劣势在于有些复杂结构会带来较高的聚体、错配、得率低等问题；Blinatumomab则属于non-IgG-like bsAb一类，这类bsAb在CMC上的优势在于结构简单，一般表达量较高，劣势则在于需要开发特定的纯化技术路线等。
如何能在IND阶段顺利完成bsAb的开发工作，需要从以下几个重点考虑：
01.细胞株开发
基于QbD理念及现实因素考虑，对于整个CMC而言，一个“天资卓越”的细胞株重要程度不言而喻，它是整个CMC的起点和基础。高效稳定细胞株兼具表达量高，产品质量好（错配/聚体低等），稳定性好等特性。这些特性直接影响到后续工艺开发、生产可及性和生产成本的控制。皓阳在2021~2022年间开发的15个bsAb项目，涵盖7种不同结构的经验，见图1。目前针对bsAb的细胞株开发，皓阳多维度做了更多的考虑和设计，主要体现在表达载体设计、宿主细胞选择、检测方法和筛选方式的设计和选择上。
图1 bsAb结构-表达量汇总
（注：商业化CD培养基常规14天Fed-batch培养工艺，；红点为Top clone titer；绿点为Top pool titer。）
针对不同结构的bsAb个性化的载体构建策略，在细胞株开发早期高通量的检测bsAb的纯度和正配率，在细胞株筛选过程中确定关键指标和技术点，以尽可能的保障能筛选到表达较优bsAb的细胞株，一个Asymmetric formats bsAb开发实例如下：
通过转染及高通量minipool筛选，得到一批细胞群，表达及质量情况如下表
其中minipool B在正配率和表达量上较其余minipool有显著优势，SEC纯度在可接受范围内，挑选minipool B进行单克隆筛选，细胞株表达及一步亲和纯化后质量情况如下表
由此可见，通过前期获得正配率较高，表达量较优的细胞群，后续筛选出理想的细胞株概率大幅提升，极大程度的减低了该Asymmetric formats bsAb后续工艺开发的难度。
02.上游工艺开发
诚然，获得一个表达高质量蛋白的细胞株对于bsAb后续开发是相对事半功倍的，但往往会存在没有筛到理想细胞株的情况。细胞株开发是相对耗时费力的限速步骤，反复重复该部分工作，结果的不确定性极大，因此带来难以考量时间和经济成本。上游工艺开发可及时介入，以期通过后天的培养条件优化改善产物质量，一个开发实例如下。
如图1中结构1所展示的Symmetric formats bsAb，由于分子结构的复杂性导致蛋白分泌时出现断裂，且碎片无法经纯化有效的去除，针对该热门靶点结构分子，不同公司采取了不同的处理手段，如通过对细胞因子序列的改造减少断裂（WO2018205985A1）。该项目在未经序列优化的情况下，通过高通量细胞株筛选对于断裂情况无有效改善，在选定top clone后，结合培养基开发和细胞培养工艺优化，成功降低了bsAb断裂比例，对碎片含量进行了有效控制，提高了纯化收率。后续三批中试生产收率达到65%-70%，与单抗基本一致。
图2 Symmetric formats bsAb SEC overlay
其中Tpp为克隆筛选，AP3 01-AP3 04 为不同培养条件下的3L反应器培养
03.下游工艺开发
与单抗相比，bsAb具有更加多样化的分子结构与更加复杂的副产物，如同源二聚 （Homodimer）、重-轻链错配（Heterodimeric Fc species）、半抗（Half antibody）、轻链二聚体、重链二聚体（light chain dimer，heavy chain dimer）等，对下游纯化工艺提出了更高的挑战。现阶段bsAb的纯化策略依然主要依赖于层析技术。不同于单抗的经典三步层析策略，bsAb没有固定的纯化套路，一个好的bsAb纯化策略需同时考虑副产物去除、目的蛋白收率、成本以及工艺的可放大性。
快速有效的完成bsAb纯化策略研究，首先需要了解目的蛋白的分子结构与性质，知己知彼，方能百战不殆。bsAb通常具有特殊的分子设计，以提高其正确配对率，减少副产物的产生。有时可以增加bsAb与副产物之间的差异性，提高层析步骤的分辨率；其次根据已有的平台方法，选择合适的层析工艺去除杂质；最后整体考量工艺对杂质的去除能力，制定纯化策略。一般的纯化工艺包含捕获、粗纯、精纯三个步骤。在bsAb纯化策略的制定上也可对其进行借鉴，评估每个层析工艺对不同杂质的去除能力，考虑每个步骤输入条件与输出结果，有效连接各个层析工艺，从而达到制备合格产品的目的。一个Asymmetric formats bsAb开发实例如下。
通过高通量细胞株筛选，获得的细胞株表达量较高，但蛋白质量与原研有所差异。通过下游工艺去除错配体，精纯后蛋白质量与原研高度相似。
图3 Asymmetric formats bsAb CEX overlay
bsAb作为抗体治疗领域的新兴概念，受到持续且瞩目的关注。多家企业已进行bsAb的战略化布局，虽然目前多数处于研发阶段，但可以预见后续的bsAb赛道将会越来越拥挤。而克服bsAb产业化过程中面临的种种挑战，需要各方携手并进，通盘考虑。相信未来会有更多的疗效强、副作用低的bsAb进入市场，为患者带来更多的选择和希望。
参考文献
[1] Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. Nat Rev Drug Discov 18, 585–608 (2019). https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1
[2] A roadmap for lgG-like bispecific antibody purification,DOI:10.1016/B978-0-08-103019-6.00008-4,(2020)
[3] Alkaline cation-exchange chromatography for the reduction of aggregate and a mis-formed disulfide variant in a bispecific antibody purification process, DOI:10.1016/j.jchromb.2014.11.002,(2015)
[4] Analytical characterization of a monoclonal antibody therapeutic reveals a three-light chain species that is efficiently removed using hydrophobic interaction chromatography, DOI:10.4161/mabs.26192,(2013)
[5] Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies, DOI:10.1093/abt/tbab007,(2021)
关于皓阳生物
皓阳生物公司基本信息
截图来源：药融云投融资数据库
据药融云数据库显示，杭州皓阳生物技术有限公司成立于2015年，专注于为抗体/重组蛋白客户提供早期成药性评估、抗体药物偶联开发、稳定细胞株构建、工艺开发、中试生产、IND申报和临床样品生产，培养基开发定制等多平台一站式研发服务。在上海杭州两地设有研发中心和生产基地，目前拥有员工200余人。上海研发中心依托多种分析手段和瞬时表达平台为客户提供从人源化设计，活性分析到成药性分析多维度的分子设计和评估。杭州中心拥有自主开发可授权的高表达稳定细胞株平台（皓越）和工艺开发平台，建有完善的250L和500L规模原液和成品GMP生产线，能够在8个月左右提供从DNA到毒理批样品交付，12-15个月内完成IND申报准备工作。同时公司还在建6*2000L商业化生产线，预计于2024年底陆续投入使用。皓阳生物致力于通过帮助新药研发，推动生物医药领域的进步，实现创新为民、科技惠民的目标。
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