药物多晶型的定量检测方法探讨

晶型

药事纵横

2022/12/01

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药物的多晶型即指药物存在两种或以上不同晶型物质，可能包括水合物晶型、无水合物晶型、溶剂合物晶型等。不同晶型可能会对药物的理化性质产生较大影响，比如晶型粒子的表面积、结晶状态和粒径大小会影响药物的溶出速度；不同结晶粒子还会影响药物的溶解度、生物利用度和稳定性等，从而影响产品的有效性、安全性及质量可控性。但有些时候，企业也会选择这些高能量、亚稳态晶型或者无定形来提高产品的生物利用度或者规避有关专利等，故对于多晶型药物，国际药物监管机构会要求新药和仿制药的申报者提供资料充分证明对其晶型有足够了解和控制，需要企业建立晶型药物的质量标准，包括晶型种类、纯度、比例以及质量控制标准，对于晶型的质量控制，则需要开发一种可用于晶型定性、定量检测分析的方法，来保证药物质量的一致性、稳定性、安全性及有效性。

关于不同晶型物质的鉴别，常用的定性检测方法有：光学显微镜法、偏光显微镜法、单晶X射线衍射法（SXRD）、粉末X射线衍射法（PXRD）、拉曼光谱法、差示扫描量热法（DSC）、红外光谱法（IR）、动态水吸附法（DVS）、热重法（TGA）等。晶型定量检测方法可能包括有：单晶X射线衍射法、粉末X射线衍射法、红外光谱法、差示扫描量热法等，本文就这几种常用的定量方法做简单介绍。

1. X射线衍射法

X射线衍射法是利用原子对X-射线的衍射效应，完成对物质结构、成分、物质晶型的定性、定量研究。它是国际公认的晶型药物定量质量控制的重要手段。它包括单晶X射线衍射法（SXRD）和粉末X射线衍射法（PXRD）。单晶X射线衍射法是以一颗单晶体作为研究对象，从分子层面给出不同晶型药物的分子排列规律、分子构象结构等三维立体结构信息、结晶水含量等定量信息；粉末X射线衍射法则是以无数粉晶物质样品作为研究对象，可用于物质状态、成分、晶型质量控制等分析研究。其中，粉末X射线衍射法是常用的分析检测方法，它的图谱如同人的指纹一样，由衍射峰数量、位置、峰强、衍射峰几何拓图特征构成。当晶型固体物质是由两种或以上的混合晶型物质组成时，其粉末X射线衍射图谱是按照每种晶型物质特征性图谱进行物理方式的叠加，混晶样品的衍射图谱衍射峰强度也会随着样品混合比例的改变而变化。该方法使用方便，被测样品不需要复杂的前处理过程，仅需研磨即可，可适用于原料药的晶型分析、制剂中的晶型种类及不同晶型的定量分析。PXRD的定量分析方法又包括单峰法和全谱拟合法[1]。

单峰法：即选取特征衍射峰，建立特征衍射峰峰强度与被测药物中各晶型组分的对应关系。同一药物在不同混晶的情况下，建立混合物中的各种晶型含量与特征峰衍射强度关系的标准曲线，可以实现对原料药的晶型种类和比例的含量测定。该方法简单，对样品的信息要求较低，灵敏度也相对较高，是常用的一种定量分析方法。例如有文献应用PXRD的单峰法测定地氯雷他定中晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的比例，首先选择不同晶型的特征衍射峰，晶型Ⅰ选择2θ=29.4°为特征衍射峰，晶型Ⅱ选择2θ=22.4°为特征峰，以5份晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的不同比例混合对照品样品的特征峰面积和重量比进行线性回归，得到线性方程：y=2.3205x-1.5641(r=0.9986)。

应用建立好的标曲对实际不同批次的样品进行测定，计算晶型Ⅰ的含量，由结果可知样品中晶型Ⅱ的比例较小，基本不超过10%[2]。

单峰法虽简单，但是它也有弊端之处，比如单峰法的定量方法严重依赖于标样的纯度，而且制备样品时所产生的择优取向效应也会影响该方法的准确性；且由于样品受到辅料的稀释，样品的特征峰强度会被削弱，所要求的检测限提高等。因此，晶型的单峰定量方法在实际应用中需要严格控制操作条件，且通常也会与其他方法例如XRPD会和傅里叶红外光谱或拉曼光谱联合，以减少相应误差。

全谱拟合法：即建立全谱峰强度与被测药物中各晶型组分的对应关系。它是以化学计量学为基础，如偏最小二乘法、全粉末图谱分解法、Rietveld法等方法对样品进行定量分析，其信噪比、灵敏度和专属性均比单峰法有明显提高。该方法不需要提供不同晶型样品的标样，但是对样品信息的要求较高，需要提供混合物中每个相的晶格参数、空间群对称性、质量吸收系数、原子坐标、位置占有率等参数来模拟粉末衍射图谱，虽定量测定结果更加准确，但是方法建立和计算过程非常复杂，对样品图谱的解析能力要求也较高，所以实际推广可能应用较少。如有文献通过Rietveld法使用Fullprof软件建立了法莫替丁晶型A和晶型B混合物的定量分析方法，该方法首先是需要结合XRPD图谱得到一个计算模型，然后用含量为50%（w）的晶型A和晶型B的混合物对该计算模型进行修正，修正后即可用于晶型的定量分析，由结果可知计算值与实际值非常贴合，准确度很高[3]。

2. 红外光谱技术

不同晶型药物的红外吸收光谱差异，主要表现在峰形变化、峰位偏移、峰强度改变等。在用红外照射时，分子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化学键或官能团吸收频率不同，因此在红外光谱上将处于不同位置，从而可以获得分子中任何化学键或官能团的信息。但对于多晶型样品，由于不同晶型样品的分子结构完全相同，因而只有在不同晶型分子间作用力发生变化或者溶剂分子介入时，才能表现出图谱的差异，且该方法易受样品中杂质的干扰影响，其谱图差异不及XRD图谱差异明显，因此一般只作为定性鉴别和辅助定量鉴别方法。在药物的多晶型分析过程中，由于样品在研磨过程中可能会造成药物的晶型发生变化，因此常用石蜡糊法或扩散反射傅里叶红外光谱法进行红外光谱测定。例如有研究者采用衰减全反射红外光谱法测定拉米夫定晶型Ⅱ的含量，先选择晶型Ⅱ的定量吸收峰，由图谱可知晶型Ⅱ在850cm-1处有明显的吸收峰，而晶型Ⅰ在此处无干扰，因此选定该位置作为晶型Ⅱ的特征吸收峰。

通过配置不同比例的晶型Ⅰ和晶型Ⅱ混合物样品，将图谱进行叠加，并在500~1000cm-1范围内进行满刻度显示，由图知785cm-1的吸收峰为最大峰，850cm-1的吸收峰强度呈明显的浓度依赖性，因此把785cm-1的吸收峰作为内标峰，以定量峰和内标峰的吸收度之比对浓度进行线性回归，得到线性方程A850/A785=5.949*10-3C+0.00902(R=0.9935)。对不同批的原料或片剂进行红外光谱测定，可知：原料的晶型纯度均较高；而制剂样品中有一批样品中晶型Ⅱ的含量为93.7%[4]。

3. 差示扫描量热法（DSC）

该方法是基于热力学原理和物质热力学性质而建立的分析方法。利用不同晶型物质特有的热力学性质，通过供试品吸热峰或放热峰的数量、位置、形状、吸热量等参数变化实现对晶型物质状态的定性、定量鉴别。该方法操作简单，试样用量少且样品不需要预处理，但它仅适用于不同晶型物质的熔融吸热峰存在较大差异或供试品中含有不同数量和种类结晶溶剂的晶型物质的鉴别。例如有文献应用差示扫描量热法定量研究阿德福韦的不同晶型，分别对A、E两种晶型样品进行DSC分析，结果可知两种晶型具有明显不同的熔点，A晶型的熔点为100℃，E晶型的熔点为93℃，两种晶型的熔融峰可以明显区分开，有利于利用熔融热焓的数据对不同晶型的含量进行定量分析。分别配置含不用比例的A和E晶型的混合样品，进行DSC测定，混合物样品测量用量约1mg左右，混合物DSC的测试曲线结果如图5。

应用该DSC方法测定阿德福韦样品在二氯甲烷溶剂中0~5℃重结晶获得的样品以及在室温20~25℃放置30d后的样品，通过计算可以知道样品中A晶型的含量从11.2%提高到了25.6%，即在室温放置过程中有部分非晶组分转成了A晶型[5]。

4. 拉曼光谱法

拉曼光谱法是以拉曼效应为基础研究分子振动的一种方法，是研究分子和光相互作用发生散射光的频率，该方法可以利用不同晶型物质特有的分子极化率变化，引起指定波长范围的拉曼光谱吸收峰位置、强度、峰形几何拓扑等参数变化，从而实现对晶型的定性、定量鉴别。而同种化合物的不同晶型，由于其堆积方式不同会导致分子振动有所不同，故而可以用来区分多晶型物质。拉曼光谱法和红外光谱法均属于振动光谱，但拉曼光谱检测低频振动较红外光谱具有更明显的优势，甚至可以检测到分子的晶格振动，因此拉曼光谱在鉴别药物的多晶型方面具有显著的优势作用。该方法测定简单，检测样品不需要预处理，可直接检测，可以避免样品处理过程中对晶型的影响。但该方法尚不成熟，暂不具权威性，一般可作为晶型定量分析的辅助分析手段。荧光干扰是拉曼光谱分析中常遇到的问题，需要通过摸索合适的曝光时间和采样次数，并且采用基线矫正，可以一定程度上减少荧光干扰。另外拉曼光谱信号绝对强度波动较大，使用同一样品多次测量，衍射峰强度的偏差可能达到20%，因此常采用内标法来定量分析，固体样品可以采用样品中某一位置的峰强作为内标或参比，可以一定程度上提高定量结果的准确性[6]。

例如有研究者应用拉曼光谱法辅助定量检测拉米夫定晶型Ⅰ的含量。研究者先用XRD定量分析Ⅰ晶型，发现虽然Ⅰ晶型的特征峰明显，但是峰强明显弱于晶型Ⅱ，且晶型Ⅰ为针状晶体，择优取向会导致特征峰的强度重现性较差，较难应用于晶型Ⅰ的定量分析，而在拉曼光谱中，晶型Ⅰ在697cm-1有明显的特征散射峰，晶型Ⅱ在该位置处无干扰，因此用拉曼方法辅助定量分析晶型Ⅰ的含量。将不同比例的晶型Ⅰ和晶型Ⅱ混合物样品的图谱进行叠加，发现697cm-1 散射峰强度呈明显的浓度依赖性，选择该位置作为定量峰；两种晶型在537cm-1处均有散射峰，且该位置未受其他峰干扰，峰形良好，将该位置作为内标峰，采用定量峰和内标峰的强度比对浓度进行线性回归，得到线性方程为I697/I537=7.152*10-3C+0.003143(R=0.9986)。取原料适量进行拉曼光谱测定，采用标准曲线法进行计算，由图5结果可知并未检出晶型Ⅰ[6]。

另外除了以上几种定量方法外，如果原料的不同晶型物质溶解性质存在较大差异时，也可以尝试建立晶型物质与溶解度或溶出度的关系研究，以溶解度或者体外溶出度、溶出速率作为晶型的定量评价辅助方法。本身药物所存在的多晶型研究就比较复杂，还要做到准确的定量研究就更难，我们一般会结合各个晶型的特点比较多种表征方法，最终选择特征性更强、重现性更好的检测方法。如果有可能的话，通常还会借助多种检测技术的联合应用来提高晶型定量检测的准确性。