温医大李校堃院士团队蔡跃飘/戴士杰课题组J. Med. Chem.：受体结合肽衍生物用于靶向FGFR肿瘤免疫治疗新策略

近年来，越来越多的临床和临床前研究数据显示，成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptors，FGFRs）的过表达与激活与多种类型肿瘤的发生、发展以及抗肿瘤治疗的耐药性密切相关。这些过表达的细胞表面受体被视为抗肿瘤治疗的理想靶点。在各种靶向治疗分子中，受体结合肽在癌症治疗中发挥着多种功能，显示出巨大的应用潜力。分子量适中的受体结合肽具有多种优势，包括易于选择和合成、低免疫原性和毒性、高选择性、可预测的代谢终产物等，因此可以作为小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）或单克隆抗体（mAbs）的替代品。然而，并非所有已发现的靶向结合肽都能有效占据蛋白–蛋白相互作用（PPI）位点，并通过阻断PPI信号通路发挥生物功能。此外，受体结合肽易被蛋白酶降解、体内稳定性差和半衰期短等因素，严重阻碍了其作为肽拮抗剂的有效性。

受体结合肽衍生物用于靶向FGFR肿瘤免疫治疗新策略

图1 基于抗体募集策略，FGFR1靶向肽的成药性改造用于抗肿瘤活性研究示意图（来源：J. Med. Chem.）

近日，温州医科大学李校堃院士团队蔡跃飘/戴士杰课题组在药物化学顶尖期刊Journal of Medicinal Chemistry上报道了一种利用小分子半抗原定点修饰受体靶向肽用于FGFR肿瘤治疗的新策略（图1）。该课题组以天然存在的FGFR1靶向肽Pep1（氨基酸序列：YRSRKYSSWYVALKR）为模型肽，通过Sortase A（SrtA）介导的连接反应（SrtA-mediated ligation, SML）高效合成出具有不同PEG连接臂（n = 1, 3, 6）的Pep1-DNP偶联物。通过免疫荧光和表面等离子体共振（SPR）实验，分别在细胞水平和分子水平证明了Pep1和Pep1-DNP偶联物均具有FGFR1胞外区特异性靶向结合能力（Pep1：KD=1.60 µM；7：K_D=5.95 µM；8：K_D=5.34 µM；9：K_D=5.01 µM）（图2）。CCK-8和Western blotting实验结果表明，Pep1-DNP偶联物保留了Pep1原有的FGF2依赖的细胞增殖抑制活性和促凋亡作用。

图2 Pep1 和Pep1-DNP 偶联物的FGFR1c靶向结合能力测定结果。（来源：J. Med. Chem.）

在体内抗体募集能力实验和CDC实验中，课题组选择了FGFR1高表达的大鼠骨骼肌成肌细胞L6-FGFR1c^WT以及天然FGFR1过表达的癌症细胞H1581作为阳性细胞。荧光共聚焦实验结果显示，与PBS和Pep1处理组相比，三种偶联物均具有招募抗体的能力（图3a）。进一步通过流式细胞术对其抗体募集能力进行定量，结果表明，与PBS和Pep1处理组相比，三种偶联物均表现出浓度依赖性的抗体募集，并且DNP抗体的募集能力与偶联物结构中PEG的长度相关（图3b）。此外，在CDC实验测定中，偶联物9在两种阳性细胞模型中分别具有45.8%（L6-FGFR1c^WT）和44.5%（H1581）的细胞裂解率，免疫杀伤作用明显优于未修饰的Pep1。

图3 通过免疫荧光（a 和 b）和流式细胞术（c和d）对Pep1-DNP 偶联物的DNP 抗体招募能力进行测定。（来源：J. Med. Chem.）

在药代动力学实验中，Pep1-DNP偶联物9的血浆T_1/2为18.09小时。与未修饰的母体肽相比，Pep1-DNP偶联物9的血浆半衰期增加了8.53倍。这一结果表明，当体内存在丰富的抗DNP抗体时，半抗原DNP修饰的Pep1可以显著延长其半衰期。在体内抗肿瘤活性测定实验中，Pep1和Pep1-DNP偶联物9的肿瘤抑制率分别为44.2%和72.7%，表明经过DNP修饰后的Pep1对肿瘤生长的抑制作用显著。此外，通过对小鼠体重的称量、各组织HE染色以及肝肾功能指标（AST、ALT、Crea和Urea）的测试结果表明，Pep1和Pep1-DNP偶联物9具有良好的安全性（图4）。

图4 Pep1-DNP 偶联物9的体内抗肿瘤活性测定结果。（来源：J. Med. Chem.）

综上所述，利用小分子半抗原作为内源性抗体粘合剂，对FGFR1靶向结合肽Pep1进行定点修饰，不仅能够有效延长其在体内的循环半衰期，还能赋予靶向肽利用先天性免疫机制消灭肿瘤细胞的能力。值得注意的是，这种有益效果无需受体结合肽占据蛋白-蛋白相互作用界面（PPIs）位点。鉴于学术界和制药行业发现了越来越多具有肿瘤靶向特性的先导肽，该方法可方便地应用于其他靶向肽的临床转化。

该课题得到国家自然科学基金（82204217）和温州市基础科学研究计划项目（Y20220203和Y2023932）的资助。感谢温州医科大学科研中心和温州市中药研究与转化重点实验室的支持。同时，感谢温州医科大学药学院分析测试中心的王贤亲和吴佳敏在MS和SPR测定方面提供的帮助。此外，还感谢江南大学吴志猛教授在CDC检测中给予的协助。

温州医科大学药学院2021级硕士研究生李晓会、温州医科大学附属第一医院刘海雁医士和2022级硕士研究生丁圣洁为该论文的共同第一作者，赵伟欣副教授、蔡跃飘教授和戴士杰副研究员为该文的共同通讯作者，温州医科大学为该文的第一通讯单位。

Chemoenzymatic Synthesis of DNP-Functionalized FGFR1-Binding Peptides as Novel Peptidomimetic Immunotherapeutics for Treating Lung Cancer

Xiaohui Li, Haiyan Liu, Shengjie Ding, Ziyu Tian, Jia Song, Huayu Zhong, Luwei Fu, Xiaojun Cai, Fengyu Huang, Kun Wang, Lilong Dong, Weixin Zhao*, Yuepiao Cai*, and Shijie Dai*

J. Med. Chem. 2024, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c00967