Nature +1｜碧迪流式及单细胞助力神经系统自身免疫疾病机制研究

格林-巴利综合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是一种以神经髓鞘受损为表现形式的神经系统疾病，大多数患者在发病前都有过前驱感染暴露史，包括呼吸道感染与胃肠道感染等。目前病因不明，主流认为该病的发生与自身免疫有极大关系。患者的临床表现包括弛缓性肌无力，严重者可因为呼吸系统问题导致死亡。已有研究集中在B细胞产生自身免疫抗体识别髓鞘蛋白（P0、P2、PMP22等）导致疾病发生，但是T细胞在该病发生发展中的功能及机制并不明确。

2023年11月，瑞士苏黎世联邦理工学院微生物研究所Latorre团队在《Nature》（IF=64.8）杂志上发表题为《Autoreactive T cells target peripheral nerves in Guillain–Barré syndrome》的研究论文。为了探究T细胞对GBS发病的影响，该研究利用BD Rhapsody单细胞平台分析GBS患者血液及神经组织内T细胞的综合图谱及TCR的序列特征，发现了GBS患者体内存在针对自身髓鞘蛋白的特异性CD4⁺ T细胞。这一发现从全新的角度揭示了GBS发病的机制，为GBS患者的治疗提供了新的思路。

利用髓鞘蛋白（P0、P2、PMP22）抗原或者流感病毒抗原刺激外周血来源的记忆CD4⁺ T细胞，作者发现只有GBS患者体内的记忆CD4⁺ T细胞能够被髓鞘蛋白抗原激活，而健康人体内的记忆CD4⁺ T细胞不能被激活。并且无论在GSB的急性发病期还是恢复期患者体内都有记忆CD4⁺ T细胞被自身髓鞘蛋白抗原激活的现象，表明GBS患者体内持续存在被自身髓鞘蛋白激活的记忆CD4⁺ T细胞。

图1、BD Aria流式分析表明在GBS患者体内存在被自身髓鞘蛋白激活的T细胞

A、急性发病期与恢复期GBS患者外周血来源CD4⁺ 记忆T细胞均能够被自身髓鞘蛋白（P0、P2、PMP22）刺激激活，导致CFSE-CD25⁺ICOS⁺细胞比例升高。在健康人外周血来源CD4⁺ 记忆T细胞则无此表型出现。

为了进一步分析GBS患者体内自身反应T细胞的亚型及TCR序列等细胞特征信息。作者利用BD Rhapsody单细胞平台针对GBS患者的CD4⁺ 记忆T细胞进行分析，利用自身髓鞘蛋白或者流感病毒抗原进行刺激后，自身髓鞘蛋白刺激组检测到1980个T细胞，流感病毒抗原刺激组检测到2232个T细胞。UMAP图显示，针对抗原刺激响应的T细胞与增殖/激活相关的基因表达水平显著升高。此外，对响应自身髓鞘蛋白的CD4⁺ 记忆T细胞与响应流感病毒抗原的CD4⁺ 记忆T细胞进行比较发现，与Th1细胞亚型相关的基因在响应自身髓鞘蛋白的CD4⁺ 记忆T细胞中表达更高。进一步在UMAP图上作者发现，Th1型细胞主要与抗原刺激后的T细胞激活有关，而Th2细胞则主要富集在抗原不响应的T细胞亚群中，表明Th1亚群细胞在GBS发病过程中可能有重要的功能。此外，响应自身髓鞘蛋白的CD4⁺ 记忆T细胞的细胞毒性相关基因也有更高的表达，可能是造成GBS患者疾病进展的重要影响因素。

图2、BD Rhapsody单细胞平台分析表明在GBS患者体内存在自身反应T细胞

A、UMAP图展示自身髓鞘蛋白或者流感病毒抗原进行刺激后，GBS患者CD4⁺ 记忆T细胞中抗原响应/不响应细胞亚群的增殖及激活情况

B、Th1型细胞相关基因在响应自身髓鞘蛋白的CD4⁺ 记忆T细胞中表达更高

C、UMAP图展示不同CD4⁺ T细胞亚群的分布情况，Th1型细胞主要与抗原刺激后的T细胞激活有关，而Th2细胞则主要富集在抗原不响应的T细胞亚群中。

D、细胞毒性相关基因在响应自身髓鞘蛋白的CD4⁺ 记忆T细胞中相比响应流感病毒抗原的CD4⁺ 记忆T细胞表达更高

为了研究GBS患者体内自身反应CD4⁺ T细胞的TCR特征，研究者利用BD Rhapsody单细胞免疫组进行分析。在鉴定到的987种不同克隆型中，53%针对自身髓鞘的P2蛋白，32%针对P0蛋白，16%针对PMP22蛋白。针对不同疾病进展状态的GBS患者自身反应CD4⁺ T细胞的分析发现，存在特定的CDR3β序列在早期急性发病期及恢复期均能被检测到。针对具体的TCR Vβ序列进行分析表明，GBS患者体内自身反应CD4⁺ T细胞通过多克隆的方式识别自身抗原，进一步利用数据预测的方法同样也发现这群细胞在识别自身髓鞘蛋白抗原时识别的区域能够覆盖整个蛋白的不同区域。最后，利用TCRβ测序在不同患者体内分析自身反应CD4⁺ T细胞共有的TCRβ克隆型发现，识别P0的克隆型具有更高的占比。

图3、BD Rhapsody单细胞免疫组分析GBS患者自身反应CD4⁺ T细胞的TCR特征

A、GBS患者体内自身反应CD4⁺ T细胞对应识别不同自身髓鞘抗原的序列情况。

B、在GBS的早期发病期及恢复期均存在具有特定CDR3β序列的T细胞。

C、针对TCR Vβ序列进行分析表明，GBS患者体内自身反应CD4⁺ T细胞通过多克隆的方式识别自身抗原。

D、针对TCR Vβ序列进行mapping预测表明，GBS患者体内自身反应CD4⁺ T细胞的抗原识别区域覆盖整个蛋白的不同区域。

E、不同GBS患者体内存在具有相同TCRβ克隆型的T细胞，其中识别P0的克隆型占比最高。

由于GBS发病表现为神经髓鞘受损，而前期研究的都是外周血中的自身反应CD4⁺ T细胞。因此为了证明自身反应CD4⁺ T细胞确实能够在富集在外周神经处发挥自身免疫功能。作者获取了一个GBS患者的左腓肠神经，提取了其中浸润的CD4⁺ T细胞。同样利用自身髓鞘蛋白进行处理，流式结果表明在GBS患者的外周神经处存在浸润的自身反应CD4⁺ T细胞，可能与GBS的发生发展密切相关。进一步作者整合了数据库数据的资源，发现了一群存在不同样本内的（外周神经，脑脊液，血液）特异性识别PMP22的自身反应CD4⁺ T细胞。

图4、外周神经组织中同样存在自身反应CD4⁺ T细胞

A、流式分析结果表明，GBS患者的外周神经处存在浸润的自身反应CD4⁺ T细胞

B、整合数据库资源，作者发现一群存在不同样本内的（外周神经，脑脊液，血液）特异性识别PMP22的自身反应CD4⁺ T细胞。

以往关于GBS发病机制的研究重点集中在B细胞上，认为B细胞产生自身免疫抗体导致神经脱髓鞘时GBS发病的重要原因。但也有研究表明在部分GBS患者体内可能存在其他自身免疫机制的作用。本篇文章从T细胞角度出发，采用GBS患者的临床样本，创新性的揭示了自身反应T细胞在GBS患者体内的存在，利用BD Rhapsody单细胞测序平台分析了这些自身反应T细胞的具体分型及功能，利用BD Rhapsody单细胞免疫组分析了自身反应T细胞的相应TCR序列特征，联合碧迪流式细胞分析技术最终揭示了自身反应T细胞在GBS发病中的重要存在及功能，为GBS的药物开发及治疗提供了全新的思路与方向。