Edward Jenner（图片来源wapbaike.baidu.com）
18世纪天花流行的欧洲，每年50万人因此死亡。在Edward Jenner发明牛痘疫苗之前，欧洲人采用源自10世纪中国的天花预防经验，即将天花病人的脓包液经过干燥吹入未感染人群的鼻内或划痕接种，实现机体免疫。这种免疫方法为天花盛行年代人类的生存提供了可能，但康复人群会留下疤痕，而且接种可能导致死亡。这种粗暴的免疫方法给人类预防接种带来阴影，其影响之深远甚至持续至今。1796年Edward Jenner从挤奶女工的事例中找到了预防天花的灵感。牛痘疫苗的发明标志着“疫苗学的诞生”，Edward Jenner也因此被称为“免疫学之父”。
科学的发展，总是呈现“阶梯状”，一旦有了开始，就会不断发展。Jenner的发现为人类应对天花感染做出了重要贡献，但他并不知道其中原理。真正科学意义的疫苗诞生始于一个世纪以后，即Robert Koch（细菌学之父）和 Louis Pasteur（微生物学之父）发现引起感染性疾病的元凶是微生物之后。
Robert Koch和Louis Pasteur（图片来源www.360doc.com和courses.lumenlearning.com）
Pasteur在实验室通过干燥、热处理、暴氧及非适宜宿主传代（如猪瘟病毒在兔体内传代以实现减毒效果）等方法试图降低病原毒性。第一个实验对象是引起禽霍乱的细菌，现在也被称为“多杀性巴氏杆菌”。
第一个用减毒方法开发的人用疫苗是狂犬疫苗（狂犬病毒在兔脊髓中繁殖，通过干燥减毒）。该疫苗1885年成功应用在被病狗咬伤的男孩Josef Meister身上。尽管这种狂犬疫苗有时造成接种对象死亡，但来自欧洲，俄罗斯和美国需要接受救治的患者依旧络绎不绝（当时别无他法，毕竟这是一份生存的希望）。
于此同时，炭疽减毒疫苗问世。几年后，基于Pasteur的经验，Albert Calmette和Camille Guérin开发出应用于肺结核的BCG疫苗（即卡介苗，直至今日BCG疫苗仍是临床唯一可用的肺结核疫苗，它是通过牛型结核菌经过230次传代后获得的减毒疫苗）。
图源：https://www.skepticalraptor.com/skepticalraptorblog.php/bcg-vaccine-for-covid-19-100-year-old-vaccine-beneficial/
1888年，人类发现白喉和破伤风是由细菌外毒素导致的。随后，Emil von Behring和Shibasaburo Kitasato发现接种过这些毒素的动物，其血清可以为人体提供保护（抗毒素马血清一度成为稀缺药品）。
采集马血收集抗毒素血清（图片来源于百度）
1900s早期，微生物化学或物理灭活法广泛应用于如伤寒、鼠疫、霍乱和百日咳灭活疫苗（这些疫苗目前大部分已不再使用，尽管其确实有效，但其反应原性过高，会导致注射部位产生发热、疼痛和肿胀等副作用）。1924年，化学法灭活毒素成功应用，白喉和破伤风类毒素疫苗问世（铝胶佐剂提高免疫原性），并沿用至今。
图源：百度
1930s中期，流感病毒在鸡胚中培养取得成功，流感疫苗问世。1949年首次实现病毒在细胞中培养，使脊髓灰质炎病毒体外培养成为可能。1950s灭活（减毒）脊髓灰质炎疫苗问世。1960s麻疹、腮腺炎和风疹减毒疫苗问世。随后，水痘带状疱疹病毒、轮状病毒和流感病毒（细胞培养）疫苗也相继问世并沿用至今
▉ 多糖结合疫苗—开启疫苗新篇章
1960s人们发现针对脑膜炎球菌多糖的抗体可为机体提供保护。于是1970s，针对脑膜炎球菌A、C、Y、W血清型的纯化多糖疫苗，抗肺炎球菌23价多糖疫苗和B型流感嗜血杆菌疫苗陆续得到开发。然而，多糖疫苗的免疫效果并不理想，科学家通过“组合疗法”解决了问题。
https://www.science20.com/science_20/vlp_vaccines_tobacco_saves_lives-84047
1970s中期，Maurice Hilleman打算研制HBV疫苗（乙肝疫苗），然而HBV无法在实验室培养，因此无法使用常规方法即先培养再灭活方式制备疫苗。在乙肝慢性感染者血浆中存在大量病毒样颗粒（VLPs），Hilleman通过纯化和灭活VLPs制备疫苗。这种疫苗确实有效，但除了安全问题，还有一个限制因素即需要感染病人持续提供VLPs（没有VLPs，疫苗就断货）。
葛兰素史克安在时TM乙肝疫苗（图片来源于百度）
▉ DNA重组技术
同年，重组DNA技术问世，Bill Rutter和Pablo Valenzuela克隆HBV表面抗原基因并在酵母系统中表达。通过这种方法，他们将HBV抗原整合成VLPs，其抗原性与从慢性感染病人血液中提纯的一致。这项技术，最先被默克和葛兰素史克商业化，通过在发酵系统中培养酵母就可大量制备疫苗。这也是人类首次不用培养致病微生物即可制备疫苗。
10年后，酵母和杆状病毒用于其他病毒VLPs制备，这些病毒都无法在实验室培养，如HPV16、HPV18。VLPs是近年来流行的疫苗形式，流感病毒、RSV病毒、诺如病毒和细小病毒VLPs疫苗都在进行不同阶段的临床试验。
DNA重组技术也在细菌学应用。1980s早期，百日咳灭活疫苗因副作用（事实or传说）而遭受批判，研究者迫切渴望找到一款非细胞纯化蛋白疫苗。1970s Yuji Sato发现百日咳菌液上清中主要含有2种蛋白：百日咳毒素和丝状血凝素（HA）。Sato通过化学脱毒全部上清液制备疫苗。在西方，科学家通过分别纯化毒素和HA，并添加百日咳粘附素（一种外膜蛋白），也有时是菌毛蛋白，这些毒素通过化学方法脱毒（甲醛脱毒法），而后制备疫苗。
使用重组DNA技术，将百日咳外毒素基因克隆并测序，通过将外毒素活性位点2个氨基酸改变来去除其毒性。诱变菌体可无限量产出遗传灭活的百日咳毒素（制备疫苗）。临床试验表明，这些遗传灭活毒素免疫效果远超化学灭活毒素10倍，可诱导更快、更强、更持久的免疫反应。本案中，重组DNA技术提高了抗原的质量和安全性。
▉ "反向疫苗学"
多糖结合疫苗在脑膜炎球菌A、C、Y、W成功运用，但在血清型B型不适用，B型却是造成50%全球脑膜炎病例的罪魁祸首。B型脑膜炎球菌荚膜多糖为α2-8连接多聚唾液酸，其结构与人体细胞糖蛋白（如神经细胞黏附分子1 NCAM1）一致，因此机体对B型荚膜抗原免疫耐受（识别为“自己”）。
为了克服这个困难，科学家尝试对多糖进行化学修饰（如引入N-丙酰基团）或对蛋白进行纯化制备疫苗，效果都不理想。一款OMVs（outer-membrane vesicles）疫苗取得了部分成功，该疫苗使用洗涤剂处理菌体，去除大部分菌外膜中毒性脂多糖和松散结合的蛋白，但像PorA这样紧密锚定的跨膜蛋白不会丢失，可诱导保护性免疫。OMVs疫苗在古巴、挪威、新西兰成功应用。该方法弊端是仅可对疫苗制备菌感染提供保护，但无法同时应对其他菌株感染（不同菌株含有不同PorA）即此种疫苗不具有交叉保护性。据美国CDC估计，如果要成功应对，应至少包含20种OMVs，这样才可以抵御至少80%的B型脑膜炎球菌感染。
1995年，流感病毒基因组测序成功标志着B型脑膜炎球菌疫苗制备问题可以通过基因组测序解决，即通过测序方法筛选传统方法无法发现的新抗原。这种依托于基因的抗原寻找方法称为“反向疫苗学”。通过计算机分析识别疫苗候选抗原，经过克隆并在大肠杆菌表达，然后用新抗原免疫小鼠，测定小鼠血清在补体存在情况下对菌体的杀灭能力。
新抗原接下来需要进行杀菌滴度检测，B型脑膜炎球菌间序列保守性分析，不同分离株表达水平衡量，以及与人体蛋白的同源性问题鉴定等。通过这种方法，最终筛选出3种抗原，与OMVs一同制备疫苗。2013年，通过反向遗传学以基因组为基础开发出第一款疫苗（Bexsero），在欧洲、澳大利亚和加拿大注册。当普林斯顿和圣芭芭拉大学出现B型脑膜炎球菌爆发，并同时存在部分学生感染时，该疫苗在美国这两所学校学生中进行了成功接种（在美国紧急获批）。
Bexsero由诺华开发，通过资产置换，GSK获得诺华疫苗业务（图片来源于网络）
尽管反向疫苗学开发疫苗周期较长，但由于其功能强大，已用于其他菌体，如抗生素抗性金黄色葡萄球菌疫苗开发（近日，美国CDC拨款2200万美元用于耐药菌及其感染性疾病研究。其中一部分款项即用于耐药菌基因组研究）。当一种病原微生物存在多种基因组时（多菌株，多血清型），需要多基因组比对，才能制备通用疫苗。对致病性大肠杆菌和普通大肠杆菌比对，可找出其致病性抗原。
利用该方法，还可进行肺炎衣原体和结核分支杆菌T细胞抗原鉴定。反向疫苗学是当前可用的筛选抗原的有力工具，可用于菌体和寄生虫全抗原（蛋白质）搜索。但该方法无法预测多糖抗原，也无法解决HIV和RSV的问题（他们的保护性抗原经常变化或存在蛋白质构像问题）。
反向疫苗学方法探索B型脑膜炎球菌抗原示意图
▉ 基于抗原结构的疫苗设计
过去几年，X晶体衍射技术，核磁共振成像，电子显微镜（三大法宝）提高了我们对蛋白质三维结构的认识，使我们可以从原子水平了解关键抗原及表位的信息。无论抗原以单独形式存在还是与抗体结合，都不影响我们对其结构的认识。如此，我们可以对抗原进行结构设计，以提高其免疫原性。
在脑膜炎球菌H因子结合蛋白案例中，科学家从3种脑膜炎球菌抗原变体中筛选非重叠抗原，产生的单分子可诱导针对所有变体的保护性抗体。对于RSV F融合蛋白，其融合前构象可诱导较高滴度中和抗体。通过对F蛋白三维结构分析，在两个氨基酸残基中引入半胱氨酸，半胱氨酸间形成二硫键，将F蛋白锁定在融合前构象，即使两个氨基酸位点靠近（融合后这两个氨基酸就会相距较远）。或许，通过这种方法可以开发出一款安全有效的RSV疫苗（目前，RSV疫苗开发仍具有难度）。
以上，仅为疫苗结构设计的开端，未来，结构设计将成为疫苗设计的常规方法，有可能用于HIV疫苗开发。
▉ 合成生物学
2010年，Craig Venter团队成功将合成的超过50万碱基的基因组植入生殖支原体细胞质，这一做法标志着体外合成DNA、RNA用于疫苗开发成为可能。
2013年4月24日，中国CDC发现H7N9流感毒株，将其HA、NA抗原序列公开。第二天，Venter实验室就合成了HA、NA抗原序列，协同载有其他6段流感RNA片段的线性质粒转染细胞，几天后，分离出“新病毒”。该病毒作为亚单位疫苗种子，在细胞中培养。I期临床试验表明，其可诱导保护性抗体（这是合成生物学研究成果首次在人体开展试验）。在流行病爆发时，通过该方法，可快速制备疫苗（2013年，关于Craig Venter团队和瑞士制药公司诺华合作，利用中国CDC上传的H7N9开发疫苗存在着版权问题，损害了中国的利益，后被妥善处理。本文仅探讨合成生物学在传染病爆发期间对疾病控制，疫苗制备的意义，不对其他进行评定）。
合成的H7N9 HA也可用于自扩增mRNA（SAM self-amplifying）制备。H7N9报道后8天H7N9 HA SAM就展开动物实验，二免后3周小鼠产生HA特异性保护抗体，这距离H7N9报道后还不足40天（速度之快令人赞叹）。
与之相比，或许传统疫苗还停留在病原收集，资质机构运送，病毒在鸡胚中培养，分发给制造商制备疫苗的某一阶段。而且，2020年底推出的mRNA新冠疫苗也证明了新技术手段在应对流行病方面的速度优势。
▉ 佐剂
除了疫苗的核心“抗原”以外，佐剂也很重要（佐剂为非活non-living疫苗提供了免疫激活帮助）。人类历史上佐剂经历了铝胶佐剂（1920s）、水包油乳剂（1997年诺华MF59以及GSK AS03）的变化。近年来，由于固有免疫信号传导途径的发现，TLR激动剂也用于佐剂开发：如GSK开发由MPL和铝胶构成的AS04，靶向TLR4，作为HPV疫苗的佐剂；以及文章开头介绍的Protollin和CpG（TLR9激动剂）等。
这些佐剂开启了疫苗的新时代，使抗原更具靶向性，如靶向TLR7的小分子，可携带抗原至APC和淋巴结发挥局部效应。合成小分子佐剂的设计将成为未来一个新兴领域，疫苗的用途也会由单纯的预防逐渐转变为预防和治疗相结合。
▉ 总结
公元前430年的希腊雅典（公元前431-404），瘟疫肆虐，1/3的人口因此丧生。瘟疫使人们不再关心法律，女人不再被习俗禁锢，人民失去对宗教的信仰。如今，仅在美国，疫苗就预防了超过1亿种疾病的发生。全球每年有250万人因防疫而免于死亡-折合每天7000人。疫苗，在我们的生活中分量越来越重。1796到1980年，疫苗学进展表现在新抗原发现和病原的大规模培养，用于灭活、减毒疫苗制备上。过去的40年，反向疫苗学、结构疫苗学、合成生物学为疫苗学发展带来新动能。佐剂的发展给疫苗学增添色彩，系统生物学为疫苗安全性和免疫效果的分子机制提供理论依据（通过建立代谢和免疫的关系，未来通过区分PBMCs基因表达，科学家就可判定疫苗的免疫效果，或者用于疫苗的开发设计）。或许未来某一天，我们不再需要大规模的临床试验，便可对药物，对疫苗进行评价，获知其安全性和有效性的可靠信息。
Illustration by Jennifer Broza
参考文献：
1. A novel intranasal Protollin-based measles vaccine induces mucosal and systemic neutralizing antibody responses and cell-mediated immunity in mice.Sophie Chabot.Vaccine. 2005 Feb 3;23(11):1374-83.
2. From empiricism to rational design:a personal perspective of the evolution of vaccine development.Ennio De Gregorio and Rino Rappuoli. IMMUNOLOGY.2014 July.Vol 14.
编辑人：宁帅同学
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