洞见六大方法学预验证关键点！

分析方法

药事纵横

2022/12/02

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药品的质量可控性通过研发中的质量研究与生产中的质量控制的方式实现，在药品质量控制过程中有很多检测项目，每个检测项目会对应一个分析方法，每个分析方法需要有一定的理论基础和保证提供的检测数据真实、准确和灵敏，因此，针对新开发的分析方法，变更的分析方法等均需要进行方法学验证以保证分析方法在实际应用中的可行性。分析研发人员在分析方法验证之前往往会对一些项目进行预验证，也可以理解为在方法开发过程中初步的判断方法的适用性，那么如何选择方法学预验证中的项目呢，本文结合具体实例对方法学预验证中的关键点进行了几点思考，希望与广大同行共同探讨研究。

实例一：在某有关物质的HPLC分析方法的方法学验证中，杂质A的LOQ浓度点的回收率总是偏高，已知该分析方法为等度洗脱。

原因调查：在改变有机相比例过程中，发现加标的系统适用性溶液在杂质A相邻位置多一个未知杂质的色谱峰，并且在忽略限以下，因为原分析方法中杂质A与该未知杂质未实现基线分离导致LOQ浓度点杂质A的回收率总是偏高；

方法学预验证关键点一：耐用性的考察。在方法开发之初，以API为例，通过对粗品、强制降解试验样品和加标系统适用性样品的分离度考察方法的专属性，拟定分析方法之后通过耐用性的预验证（改变柱温、流速、有机相比例、盐浓度等）或许可以优化出更佳的分析方法，特别是在更换色谱柱的考察中可以确定方法是否对色谱柱的选择性较高，尤其是应用非新色谱柱开发方法时，在更换新批号同款色谱柱时方法无法重现，出现峰形变差，分离度变低等情况，需要考虑优化开发的方法，或者考虑如何处理新买色谱柱后用于本方法的使用（如方法中采用离子对试剂为流动相，需要长时间的平衡色谱柱，否则可能出现方法无法重现的情况发生，那么在方法转移中就会出现比较大的麻烦。或者个别的方法需要在新购置的色谱柱中重复进样供试品浓度一定的针数后，才能满足系统适用性的要求等）。

实例二：在某API有关物质的HPLC分析方法的方法学验证中，专属性验证中，拟进样顺序酸碱破坏空白-酸碱破坏样品-氧化破坏空白-氧化破坏样品……，在破坏样品进样后，空白样品中在主峰位置出现较大的残留，如图1和图2所示。

原因调查：排除进样瓶、容量瓶等溶液制备中产生的残留，残留来自进样针，更改洗针液和延长洗针时间后，残留问题解决。

方法学预验证关键点二：考察待测组分的溶解度，优选合适的洗针液，并且考察不同的洗针次数和时间；

实例三：在某API有关物质的HPLC分析方法的方法学验证中，各杂质峰形均良好，但是其中一个异构体的杂质B峰形对称性一般，如图3中所示。

方法学预验证关键点三：线性与回收率的考察。因为杂质B的色谱峰对称性一般在预验证中考察线性是否能通过，并且通过加标试验考察回收率，确定杂质B的回收率是否能满足方法学验证的要求。

实例四：在某API含量的方法学验证中，发现对照品溶液随着时间的延长峰面积逐渐的减小，经过计算分析，在进样6h峰面积RSD为3.2%，进样4h峰面积RSD为1.8%，拟定溶液稳定性的可接受标准为各时间点峰面积的RSD≤2%；

方法学预验证关键点四：对照品溶液稳定性考察，包括对照品贮备液、对照品溶液分别在进样室内和冰箱内的稳定性，以便确定溶液是否临用新制，是否需要控制进样室的温度。当然，同时考察供试品溶液的稳定性，考察溶液是否需要临用新制。稳定性考察的时间长度可以根据实际情况制定，如每针的洗脱时间，对照品是否容易购买等。如果对照品剩余数量不多，可以计算方法学各验证项完成后需要的时间，尽可能的把溶液稳定性的考察时间延长。另外，如果供试品及对照品的制备中应用的纯有机试剂为溶剂，更应该对溶液稳定性进行预验证，根据考察结果确定二级溶剂是否需要用流动相，或者是否需要控温的进样室。

实例五：某API的残留溶剂GC分析方法学验证中，采用外标一点法进行定量计算，回收率不符合要求；

原因调查：API的基质效应比较大，通过标准加入法重新考察方法的回收率后，结果符合方法学验证的要求；

方法学预验证关键点五：定量方法的准确性，对于受基质效应影响较大的方法需要对定量方法的选择进行优选。如果采用加校正因子的主成分自身对照法进行杂质定量时，需要对校正因子的影响因素进行考察，避免发生定量偏低，检测结果不准确的情况发生。

实例六：某有关物质的HPLC分析方法在转移时，接收方总是出现鬼峰。

原因调查：样品在进样之前经过滤膜过滤，转移方一般会用10ml左右的溶剂润洗滤膜，而接收方只是用溶剂过滤三滴左右，结果接收方的色谱图中总是出现一个未知的峰，并且在LOQ以上，导致分析方法转移失败。

方法学预验证关键点六：溶液配制用滴管，滤膜等干扰排查，一些一次性塑料滴管，滤膜等经常会有不明有机物迁移到样品中，在进样分析中会对检测结果造成干扰，因此，需要考察滴管是否需要应用玻璃滴管，滤膜需要预先用多少溶剂润洗，进样小瓶是否需要样品润洗及润洗次数。

综上，方法学预验证不需要将全部的方法学验证内容进行全盘预演，而是针对方法的特异性进行专属的预验证选择，当然也是优化方法或者进行方法学验证前的SOP确认的过程，经过这样的操作，最终也是为了保证方法学验证各项的顺利通过与转移，并且方法应用在有关物质检查等项目中可以给出专属、准确、灵敏的检测结果。