分析方法转移过程中遇到的几个常见问题

分析方法转移就是记录一个实验室（接收方）能够使用由另一个实验室（转移方）所开发检验方法的过程，确保接收实验室熟悉检验程序并有能力进行检验。其实质是通过分析方法转移方案，确认接收实验室有能力形成方法并获得与转移实验室相同的准确度和精密度。然而在分析方法转移过程中会遇到各种问题，在此分享几个案例。

一、HPLC仪器问题

在工厂QC实验室进行分析方法转移时，使用的第一台液相色谱仪，序列运行过程中发现系统适用性溶液的色谱图基线呈波浪状，且杂质1及杂质2几乎无分离度（明显色谱柱柱效降低导致）（详见图1）；导致色谱图基线呈现波浪状的原因可能有：检测器问题（流通池污染，这种情况需要停泵检查基线是否呈波浪状，若无，则排除检测器问题；若还是呈波浪状，则需要冲洗检测器）；管路里存在气泡（可通过排气将气泡清除）；管路有盐析出（需要用热水冲洗）。无论采取哪种措施，都需要耗费大量时间，因此更换仪器及色谱柱（该色谱柱经转移方确认系统适用性符合要求）重新试验，发现在该仪器系统下，杂质3及杂质4完全重叠（详见图2），怀疑比例阀问题。再次更换仪器，对管路进行简单冲洗（四个管路同时用10%甲醇冲洗15分钟），进行系统适用性试验，检测结果符合要求，故进行仪器精密度试验，运行6针发现每一针样品系统压力波动均无规律（详见图3），仪器精密度RSD%为9.0，因此不在进行试验。主要原因是各个管路里存在不同的缓冲盐及有机溶剂混合物，短时间无法完全置换，而使用的流动相中缓冲盐高达0.3M，导致有盐析出，系统压力波动大，进而影响仪器精密度。对每个管路用热水进行冲洗，然后用10%异丙醇清洗，再用纯化水清洗，然后平衡好仪器系统后，进行系统适用性及仪器精密度，序列正常运行。

在上述案例中，主要是仪器设备（仪器本身及色谱柱）原因导致转移不顺利。因此，在试验前首先确认仪器经过IQ、PQ确认且在效期内，仪器系统经过充分清洗，系统压力稳定，色谱柱（尽可能的备用一根色谱柱）能够满足样品检测需要（通过系统适用性溶液判断）。

 

 

二、转移用缓冲盐不同导致色谱峰分离度差异大、出峰顺序改变

在接收方实验室使用的缓冲盐是二水合磷酸二氢钠，配制的流动相走出的系统适用性溶液的色谱图与转移方（使用无水磷酸二氢钠）走出的统适用性溶液的色谱图差异明显，主要在于杂质峰之间的分离度及出峰顺序（详见图4、图5）。

从这个案例中可以看出，引起差异的主要原因是使用的缓冲盐类型不同，两者晶型不同导致配制的流动相走出的系统适用性溶液色谱图中各杂质分离度及出峰顺序改变。因此，在方法开发中尽可能的考察不同品牌、含水及不含水缓冲盐之间的差异，并在转移过程中指定试剂的品牌及类型。

 

三、样品制备过程中引入异常色谱峰

供试品溶液的制备是样品检测的关键，在转移过程中会遇到样品污染问题。转移用的样品为注射液，主成分含量低且容易污染（在转移方实验室已证明一次性塑料滴管会引入异常色谱峰；直接倒入进样小瓶也可能引起污染—接触瓶外壁导致；玻璃滴管及玻璃注射器可用；进样小瓶及瓶盖必须新开封）。然而，在接收方实验室使用玻璃滴管取样检测时，发现异常色谱峰（详见图6），故进行偏差调查。分别原样复测、原玻璃滴管取样检测，发现仍存在异常色谱峰；用一次性注射器取样检测，发现其他异常峰（详见图7）；用清洗干净的玻璃注射器取样检测，未发现异常色谱峰（详见图8），结果正常。

此案例告诉我们，对于有效成分含量极低的药物，有必要考察取样方式对检测结果的影响，取样器具需要清洗干净，操作过程也需要认真仔细。

 

 

通过上述案例可知，在方法开发过程中需要考察不同品牌、含水及不含水缓冲盐之间的差异及其他耐用性试验，考察供试品溶液的制备方式，在分析方法转移前，还应进行风险评估，确定可能影响的因素，并对风险进行评级，确定消除风险的方法。以HPLC为例：

 

方法转移中难免遇到许多问题，需要明确检验方法、关键风险因素，进行可行性研究（预实验）及现场培训，双方及时沟通，解决问题，顺利完成方法转移。