多肽固相合成中使用的缩合剂_摩熵医药(原药融云)

多肽固相合成中使用的缩合剂

多肽

药事纵横

2022/06/16

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以树脂为载体，使用固相合成技术合成多肽类药物的技术现如今已经得到了广泛的应用，如固相合成GLP-1类似物索马鲁肽、利拉鲁肽。相比于液相合成多肽，固相合成有其显著的优点：可以使用过量的物料进行反应，通过简单的对肽树脂洗涤除去过量的物料，副产物，避免了中间复杂的后处理纯化过程，提高效率；可以通过不同的保护基对侧链保护，选择性脱除，最后实现对肽链的选择性修饰，如Fmoc策略中使用Mmt、Alloc、ivDde对Lys氨基侧链进行保护，可以使用对应的HCl、四三苯基膦，水合肼选择性脱除侧链保护，最后对氨基进行修饰得到修饰肽。今天我和大家介绍一下氨基酸偶联步骤中使用的缩合剂以及使用时的注意事项

HOXT/DIC缩合体系

碳二亚胺型缩合体系，出于成本考虑通常使用HOBT/DIC，HOAT/DIC活性更高，抑制消旋作用更强但价格稍贵。有时为了防止HOBT爆炸，会使用水合HOBT，但实际上使用干的HOBT从未有报道过发生爆炸的情况。这套缩合体系使用最广泛，因为此套体系成本低，活化过程中没有碱的参与，可以更好的抑制消旋。值得注意的是Cys在碱性条件下活化时（如HXTU/DIPEA，PyXop/DIPEA等）特别容易消旋，因此推荐使用HOXT/DIC活化。以HOBT为例，活化机理见图a。

图a

氨基酸先和DIC生成氧酰基异脲中间体，之后和HOXT迅速反应生成氨基酸的HOXT活化酯（如果没有HOXT，氧酰基异脲中间体会缓慢转化成无反应活性的N-酰基异脲，见图b），高活性的活化酯与氨基缩合成酰胺。活化过程中会有脲副产物生成，如活化时间过长，会观察到活化体系变浑浊就是脲副产物析出，最后可以通过使用DMF洗涤树脂除去。

图b

使用配方：AA/HOBT/DIC=1/1/1

操作步骤：氨基酸和HOBT溶于工艺选定的溶剂中，控温下加入DIC活化，活化完成后把活化液加入固相反应器反应。

HXTU/DIPEA缩合体系

脲盐型缩合剂，通常HBTU，HATU配合三级胺一起使用。这套活化体系反应活性优于HOBT/DIC体系。一般情况下第一次偶联反应不完全的情况下可以考虑使用HXTU/DIPEA缩合体系。以HATU为例，活化机理见图c。

图c

这里需要注意一个副反应，过量的HXTU在碱性条件下会和氨基组分反应发生胍基化副反应，使肽链封端。机理见图d。产生此副反应的原因是HXTU使用过量，导致剩余的HXTU与氨基反应，因此投料时控制HXTU的量不超过氨基酸的量；或者HXTU没有与氨基酸的羧基反应完全就加入固相柱反应，因此偶联前需要充分活化以避免未消耗的HXTU与氨基发生副反应。

图d

使用配方：AA/HXTU/DIPEA=1:1:2，有时可以在其中添加HOXT，如

AA/HXTU/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但没有明确的证据表明添加HOXT能够提高反应效率或者减小消旋。

操作步骤：氨基酸和HXTU溶于工艺选定的溶剂中，控温下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反应器反应。

PyXop/DIPEA体系

磷盐型缩合剂，常用PyBop，PyAop配合三级胺一起使用。高效活化体系，一般情况下第一次偶联反应不完全的情况下可以考虑使用PyXop/DIPEA缩合体系。比起HXTU/DIPEA，这个偶联剂不会引起类似的氨基封端反应，因此在固相合成中更加受欢迎。但是质量差的或存放时间长的PyXop中吡咯的含量会增加，活化时会使氨基酸羧基封端生成吡咯酰胺，失去反应活性。机理见图e

图e

商业购买的PyBop会残留一些吡咯烷，对于固相反应来说虽然会导致活性氨基酸的当量下降，但吡咯酰胺衍生物不会引入到肽链中，因此副反应在固相合成影响不大，但是液相合成或头尾环化会产生影响。可以通过再结晶的方法将膦盐中的吡咯烷副产物从受影响的物质中除去，从而有效地抑制了上述副反应。

使用配方：AA/PyXop/DIPEA=1:1:2，有时可以在其中添加HOXT，如AA/PyXop/HOXT/DIPEA=1:1:1:2，但没有明确的证据表明添加HOXT能够提高反应效率或者减小消旋。

操作步骤：氨基酸和PyXop溶于工艺选定的溶剂中，控温下加入DIPEA活化，活化完成后把活化液加入固相反应器反应。

DEPBT/DIPEA 体系

磷酸酯型缩合剂，也称作叶蕴华试剂。反应活性高，抑制消旋作用优于HXTU/DIPEA或PyXop/DIPEA体系，特别能够抑制His的消旋。活化机理见图f

图f

Oxyma/DIC 体系

2-肟氰乙酸乙酯，使用方法和HOXT一样，抑制消旋的能力更强。不同的是Oxyma比HOXT酸性更强，因此可以抑制脯氨酸引起的二肽反应。脯氨酸氨基为二级胺，结构与哌啶类似，并且其二级胺的pKa=10.6，高于普通氨基酸pKa 8.9–9.8，在偶联脯氨酸后面的氨基酸时，裸露的二级胺可能会使Fmoc-保护氨基酸活化酯提前脱除Fmoc，与另一分子Fmoc-保护氨基酸活化酯缩合生成Fmoc-保护二肽活化酯，最终导致插入肽杂质生成。Oxyma酸性强，能够抑制脯氨酸二级胺的碱性，抑制此副反应

小结：

目前应用最多的缩合体系是HOXT/DIC，虽然活性不如HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA，但是由于活化没有碱的参与，消旋的情况会少一些。一般情况下第一次偶联使用HOXT/DIC，如果反应不完全的话再使用HXTU/DIPEA和PyXoP/DIPEA等高效活化体系复投。除了上述的几种常用缩合剂之外，还有很多新型缩合剂，他们在提高偶联效率，抑制消旋的方面表现突出。如新型脲盐型缩合剂中HATU的衍生物HCTU、HDTU、TDBTU，脲盐和Oxyma结合得到TOTU、HOTU、COMU等。见图g