多肽固相合成中使用的显色剂

在多肽固相合成中，为了能够快速定性检测氨基酸是否偶联完全、Fmoc保护基团是否脱除成功，我们通常使用一些显色试剂对肽树脂进行检测，其中茚三酮显试剂由于具有显色反应迅速，显色明显，检测灵敏度高等优点成为最常用的显色试剂。溴酚蓝，四氯苯醌等也是比较常用的显色试剂，今天我就向大家介绍一下各种显色试剂的配制，使用方法以及注意事项。

这种由Kaiser等人开发的检测方法也叫做Kaiser检测，可以清楚地显示游离胺的存在。该测试通常在氨基酸偶联过程之前和之后进行，用此试剂显色的方法，是目前应用最广泛的检测试剂。

试剂A: 80g苯酚溶于20ml乙醇，为方便配制，苯酚可以提前加热融化后配制。

试剂B: 2ml的0.001M的KCN水溶液加入98ml重蒸后的吡啶中。KCN为剧毒管制品，如果不容易得到可以不加。重蒸吡啶过程中可以加入少量茚三酮以除去吡啶中能使茚三酮变色的物质。

试剂C：5g茚三酮溶于95ml乙醇中。

取少量树脂于杜氏玻璃小管中，一般树脂的量以铺满试管底部一层为宜，之后加入上述配制好的A、B、C三种试剂各两滴，于100-120℃下加热3-5min。如果树脂显蓝色说明存在未保护的氨基，脱Fmoc完成。如果树脂无色说明偶联反应完全。

虽然Kaiser测试是目前应用最广泛的检测方法，但他也有自己的局限性，Kaiser测试不能检测二级胺（如脯氨酸），也不能检测无α-H的氨基酸的氨基（如二氨基异丁酸，α-甲基亮氨酸等α-双取代氨基酸）。其机理如下图a

茚三酮首先脱水与氨基缩合得到亚胺，因此只有氨或伯胺才能发生此步反应，随后亚胺脱羧后异构化为另一种形式的亚胺，水解后释放出出一分子伯胺和一分子醛。伯胺进一步与茚三酮发生缩合得到二聚的亚胺衍生物从而显色。对于二级胺，我们可以选择后面将要提到的四氯苯醌来显色。

四氯苯醌显色试剂也是一种比较常用的显色试剂，主要用来检测二级胺（如脯氨酸）。此外，脱Fmoc试剂一般都是二级胺（如哌啶，吗啉，二甲胺），因此也可以用四氯苯醌显色试剂来检测肽树脂从而判断使用二级胺脱Fmoc后残留的二级胺是否被洗涤干净。

试剂A: 2g四氯苯醌溶于98ml DMF中

试剂B: 2ml乙醛溶于98ml DMF中

取少量树脂于杜氏玻璃小管中，一般树脂的量以铺满试管底部一层为宜，之后加入上述配制好的A、B两种试剂各两滴，室温下放置5-10min，如果树脂显蓝绿色说明存在未保护的氨基。

显色快速而敏感，但由于显色过于敏感，偶联结束后显色常常显示伪阳性。

1g溴酚蓝溶于99ml DMA中。

取少量树脂于杜氏玻璃小管中，一般树脂的量以铺满试管底部一层为宜，之后加入上述配制好的溴酚蓝溶液，立即显色。如果树脂显蓝色说明存在未保护的氨基。

试剂A: 5ml DIPEA溶于95ml DMF中

试剂B: 1g TNBS 溶于99ml水中

取少量树脂于杜氏玻璃小管中，一般树脂的量以铺满试管底部一层为宜，之后加入上述配制好的A、B两种试剂各两滴，室温下放置10min，如果树脂显黄色或红色说明存在未保护的氨基。

以上检测试剂为多肽固相合成提供了快速的检测方法，特别适合于多肽固相合成这种多步骤的连续反应，但这种快速的检测方法缺点也很明显，它无法定量分析反应进程，只能定性检测。特别是在脱Fmoc时，80% Fmoc被脱除与99% Fmoc被脱除用Kaiser测试都会显示出阳性结果，如果Fmoc脱除步骤发生在困难序列，当只有80%Fmoc被脱除而Kaiser检测显示阳性，则很有可能造成误判为Fmoc脱除完全。此外，此种检测方法标准很难制定，检测时取树脂的量很统一，在观察检测结果完全凭借主观判断，不同的人观察同一份检测结果可能有不同的描述，特别时在进行困难偶联后检测很容出现树脂浅蓝色、树脂微浅蓝色透明，树脂无色但溶液浅蓝色，树脂浅紫色等模糊不清的结果。对于这种情况，还是建议对肽树脂进行切割，然后用HPLC进行分析。