详解抗体药物的翻译后修饰

抗体类药物由于其突出的特异性和亲和力目前被广泛的应用在自免疾病、肿瘤以及抗病毒治疗中，但是抗体分子在生物合成、纯化、储存以及给药后会因为各种各样的翻译后修饰导致分子结构的改变从而可能影响药效以及安全性。因此本文将对常见的异质性来源做简单的梳理。

二硫键是由半胱氨酸残基内的2个硫醇基团氧化形成。链内二硫键是在同一抗体链的两个Cys之间形成的，而链间二硫键是在重-重链或重-轻链之间形成。理论上，抗体的所有Cys残基都应该以明确的连接模式参与链内或链间二硫键的形成。二硫键相关的异质性包括游离巯基、硫醚的形成、半胱氨酸化和三硫键。

脱氢丙氨酸可以与游离的巯基反应，形成一个不可还原的硫醚键（-R-S-R’-）。大约有0.4%的抗体在0-4°储存时观察到了上述情况。有文献称LC与HC的链间二硫键（L214-H220）更容易出现β消除以及后续硫醚键的形成并且IgG1λ的反应速率比IgG1κ要更快。此外，脱氢步骤的可逆性可以导致Cys的外消旋，形成L型或D型。另一方面，脱氢丙氨酸的水解还会导致抗体铰链区碎片的形成。游离的巯基可以被溶液中的游离Cys共价修饰，称为半胱氨酸化。V区的半胱氨酸化很少被观察到，但是如果出现对抗体功能的影响是很大的。

硫键是通过在现有的二硫键中插入一个硫原子而形成的修饰（-R-S-S-S-R’-）, 三硫键的形成是由于细胞培养液中存在着硫化氢。三硫键的存在不会对抗体功能产生明显的不利影响，可以通过在胞培养基中加入半胱氨酸来控制。‍

N端化，是mAb的主要N端修饰之一。焦谷氨酸（pyroGlu）是由mAb重链（HC）和轻链（LC）的N端谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）的重排产生。这可以通过化学方法或谷氨酰胺环化酶来完成。N端Gln向pyroGlu的非酶性转化可导致向低分子量和低等电点的转变。在化学上，Gln到PyroGlu的环化导致N端一级胺基的丧失，因此，这些抗体的酸度会略高。Gln到pyroGlu的转化主要发生在生物反应器内，受缓冲液组成和温度的影响，对pH值的依赖性较小。磷酸钠、碳酸铵缓冲液可以增加反应的速度，水和Tris-HCl缓冲液则会降低转化速率。另一方面，Glu环化的速度要慢得多，并依赖于pH值和温度，在37摄氏度下，pH值为4.0、7.0和8.0时，mAb的L链的N端Glu的半衰期分别为4.8、19和11个月。尽管没有调查过PyroGlu形成的生物学意义，但PyroGlu的存在似乎在稳定蛋白质和肽方面起了作用，保护它们不被化学和酶降解。然而，由于没有足够证据表明N端PyroGlu的存在对H链或L链有特殊的好处，在潜在的mAb治疗的克隆选择中最好避免。

谷氨酰胺的脱酰胺速率相对Asn来说会慢很多，有实验表面谷氨酰胺在碱性pH下更容易出现脱酰胺化，同样的，如果出现在CDR区的谷氨酰胺脱酰胺会对抗体结构与抗原结合力有显著的影响。

重组治疗性抗体的糖化可能是由于在含葡萄糖的培养基中生产、配制和最终在给病人使用前接触葡萄糖溶液而发生的。尽管制剂中用作稳定剂的蔗糖在37℃下储存时可能会因水解成葡萄糖而导致糖化，但是此种情况在2-8°保存时基本不会出现。IgG1和IgG2恒定区域的糖化已被证明不影响Fc功能，包括与FcγRIIa、FcRn和Protein A的结合；然而，位于CDR内或邻近的Lys的糖化则有可能对于抗体对抗原的结合力产生影响，此种情况可以通过将CDR区内的Lys突变成Arg避免。抗体的糖化程度可以通过修改葡萄糖喂养策略和增加细胞培养过程中的游离氨基酸和含一级胺的化合物的总浓度来控制。

N-糖基化对许多真核生物蛋白质的结构和功能都很重要。前体寡糖的合成、整块转移和初步修剪发生在内质网。寡糖链的后续加工和修饰是在高尔基体中进行的。因此，糖蛋白的合成在空间上分离于不同的细胞区室。因此，合成的N糖类型取决于这些细胞区间内不同的酶对其的可及性。所有的N糖都是通过一个共同的途径和一个共同的核心聚糖结构合成的。这个核心聚糖随后被进一步细化和修改，从而产生各种不同的N-聚糖结构。虽然细菌或酵母蛋白生产系统具有显著的潜在优势，如高产量和低成本，但当目标蛋白为糖基化蛋白时，问题就出现了。大多数原核生物表达系统，如大肠杆菌，不能进行翻译后修饰。另一方面，真核表达宿主，如酵母和动物细胞，有不同的糖基化模式。在这些表达宿主中产生的蛋白质往往与人类蛋白质不一样，例如，酵母产生高甘露糖就会导致免疫原性。详细的内容我们以后会专门进行梳理。

对于目前的治疗性抗体来说，已经有足够多的分析手段来鉴别产品中的微观异质性，因此在早期开发过程中，特别要避免在CDRs内有容易降解的氨基酸残基的抗体，考察其可开发性和满足既定CQA的能力，用于评估批次间和工艺变更前后的质量可比性。因此，对于各种翻译后修饰的透彻理解对于抗体药物的临床前和临床开发以及商业化供应非常重要。