Nature: 共价结合赖氨酸和新型锌离子螯合的突变体选择性AKT抑制剂

2024年11月6日，加州大学旧金山分校的Jack Taunton研究小组在Nature在线发表了题为“Mutant-selective AKT inhibition through lysine targeting and neo-zinc chelation “的研究论文，报道了靶向赖氨酸和新型锌离子螯合的突变选择性AKT抑制剂的最新进展。

癌基因激酶AKT1在驱动细胞增殖和存活的PI3K–AKT–mTOR信号通路中占据核心节点。在多种实体肿瘤中发现了AKT1的体细胞突变。最常见的AKT1突变是PH结构域（Pleckstrin homology domain，PH domain）中谷氨酸（Glu）17至赖氨酸（Lys）的突变（E17K），导致其持续定位于细胞膜上并激活癌基因信号。

临床阶段的AKT抑制剂可以结合在激酶活性位点或激酶域和PH结构域界面的变构口袋上。在AKT家族（AKT1、AKT2、AKT3）中，这些结合位点几乎完全相同，因此，选择性的AKT抑制剂鲜有报道。

一种正构泛AKT抑制剂capivasertib近期已获批与氟维司群联合用于治疗转移性激素受体阳性（hormone-receptor-positive）乳腺癌。此外，capivasertib和ipatasertib在携带AKT1（E17K）突变肿瘤的患者小队列研究中也显示出一定的疗效。尽管取得了这些进展，高血糖的副作用是所有已测试的泛AKT抑制剂的剂量限制性毒性，高血糖及其他副作用导致capivasertib的剂量减少，可能导致对AKT1（E17K）的抑制不足。基于小鼠和人类的遗传证据，这一副作用被归因于AKT2的抑制。因此，迫切需要一种选择性抑制AKT1（E17K）而对AKT2影响较小的药物。

靶向半胱氨酸的共价药物在一些靶点（EGFR、BTK、Kras (G12C)等）取得了成功。但是，共价策略尚未应用于任何癌基因的赖氨酸突变。作者基于结构的设计、开发了可逆的水杨醛抑制剂，它们与AKT1（E17K）突变的赖氨酸共价结合。这些抑制剂形成依赖于E17K的锌螯合物，从而在细胞中实现了持续的靶标结合（target engagement），并对野生型AKT表现出显著的驻留时间（residence time）选择性。

文章的主要内容如下:

基于结构的设计和可逆共价AKT1 (E17K) 抑制剂的生化特征分析

E17K突变位于PH结构域中高度极性的磷酸肌醇（phosphoinositide）结合槽内，该区域距离激酶的ATP结合位点较远。作者将E17K突变模拟到与临床变构抑制剂ARQ092复合的AKT1晶体结构中，观察到突变赖氨酸的ε-氨基离抑制剂大约8 Å距离（图1a），这提示可以使用水杨醛基团捕捉赖氨酸17的ε-氨基。然而，在变构口袋附近7-10 Å处有另外三个赖氨酸（Lys179、Lys276和Lys297）。这会带来的潜在选择性问题，因为它们在所有AKT（AKT1、AKT2、AKT3）中保守。

在计算模型的指导下，作者设计了连接基团与水杨醛相连的化合物1–3（图1b）。作者将纯化的重组AKT1（E17K或WT；1 µM）与固定浓度的每种化合物（5 µM，15分钟）处理后，进行短暂的NaBH4处理以量化共价加合物的形成，NaBH4会将可逆的亚胺转化为稳定的胺，以便进行蛋白质质谱分析。使用水杨醛化合物3处理后，形成了100%共价修饰的AKT1（E17K）。WT AKT1也发生了共价修饰，但程度稍低（平衡时修饰率为96%）（图1c）。对AKT1（E17K）和化合物3经NaBH4还原后的复合物的胰蛋白酶肽段进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，证实赖氨酸17是主要的共价修饰位点，而在WT AKT1中化合物3主要修饰赖氨酸297。化合物3在赖氨酸297存在的情况下优先与赖氨酸17共价结合，以及共价AKT1（E17K）复合物相对于WT AKT1的较长驻留时间和热稳定性（图1d），表明与赖氨酸17形成的亚胺加合物在水解方面更加稳定。

图1：基于结构的设计和可逆共价AKT1 (E17K) 抑制剂的生化特征分析。a. AKT1（E17K）与ARQ092复合的模型（基于PDB 5KCV），突出显示了邻近的赖氨酸。b. 水杨醛化合物1–3的化学结构。c. AKT1（E17K或WT）（1 µM）与溶剂或化合物3（5 µM，37 °C，15分钟）处理后，经NaBH4（10 mM，5分钟）还原后的蛋白质质谱。d. 通过加入过量的ARQ092（50 µM）在37 °C下持续孵育，预先形成的AKT1-配体复合物（1 µM AKT1，5 µM配体）的解离。在指定时间点加入NaBH4（10 mM，5分钟）终止反应后，通过蛋白质质谱测定共价修饰的AKT1的百分比。

细胞内AKT结合和基于停留时间的选择性

为了验证细胞内AKT1的结合，作者首先在稳定过表达FLAG–AKT1（E17K）、FLAG–AKT1（WT）的BEAS-2B肺上皮细胞中进行热迁移实验。在细胞中，化合物3对AKT1（E17K）的稳定作用（熔点变化ΔTm=18.8°C；图2a）超过了其在WT AKT1的稳定作用，表现出选择性。与化合物3相反，ARQ092在细胞中优先稳定WT AKT1，而非AKT1（E17K）（图2a）。

作者合成了水杨醛探针3-炔基（图2b），以直接评估细胞中的共价靶标结合情况。炔基基团可以通过铜催化的Click反应与荧光素-叠氮或生物素-叠氮试剂连接，进行探针修饰蛋白的可视化或亲和力富集分析。与蛋白质质谱分析的结果一致，3-炔基快速修饰了AKT1 (E17K)和WT AKT1/2，且该过程可被ARQ092预处理阻断（图2c）。即使不经过洗脱步骤以增强基于驻留时间的选择性，3-炔基仍以剂量依赖性方式修饰AKT1 (E17K)，其半最大有效浓度（EC50）为28 nM，比WT AKT1具有2.4倍的效力，并对AKT2显示出显著的140倍效力提升（图2d）。在用3-炔基处理后，细胞被洗入含有强效竞争剂ARQ092（5 µM）的培养基中，并随着时间推移，定量分析3-炔基修饰的FLAG–AKT的减少。3-炔基从野生型AKT1和AKT2解离的半衰期分别为45分钟和10分钟，而在3小时的追踪期内，AKT1 (E17K)的共价修饰减少不到10%（图2e）。这些结果表明，在细胞中，AKT1 (E17K)相对于野生型AKT1的基于停留时间的选择性甚至高于纯化的蛋白质。

图2：细胞内AKT结合和基于停留时间的选择性。a. 对BEAS-2B细胞中FLAG–AKT1（E17K或WT）的细胞热迁移实验（thermal shift assay）。b. 3-炔基化合物的结构。c. 过表达指示FLAG–AKT构建体的BEAS-2B细胞用ARQ092（5 µM）或DMSO处理15分钟，随后用3-炔基（2 µM）处理45分钟。细胞裂解并用NaBH4（10 mM）还原后，标记的蛋白与TAMRA-叠氮进行连接，并通过凝胶内荧光成像可视化。d. 用递增浓度的3-炔基处理指示的BEAS-2B细胞系6小时。细胞裂解并用NaBH4（10 mM）还原后，标记的蛋白与TAMRA-叠氮进行连接，并通过凝胶内荧光成像可视化。e. 用3-炔基处理指示的BEAS-2B细胞系（E17K和WT FLAG–AKT1用2 µM，FLAG–AKT2用10 µM）4小时。将培养基更换为含ARQ092（5 µM）的培养基以启动竞争性置换。在指定时间点裂解细胞并用NaBH4（10 mM）还原。标记的蛋白与TAMRA-吡啶甲基叠氮连接，并通过凝胶内荧光成像可视化。

化合物抑制AKT1 (E17K)介导的信号传导与癌细胞增殖

由于缺乏对突变体有选择性的抑制剂，以往无法测试药理学阻断内源性AKT1 (E17K)是否足以抑制致癌信号传导。因此，作者比较了化合物3和ARQ092对E17K突变LAPC4-CR细胞的细胞活力和AKT信号传导的影响。用化合物3处理E17K突变LAPC4-CR细胞72小时显著降低了细胞活力（EC50 = 20 nM），效果与临床使用的全AKT抑制剂ARQ092相似（EC50 = 37 nM）（图3a）。相比之下，SkBr3细胞对化合物3的敏感性降低了50倍（EC50 = 1.0 µM），而对ARQ092的敏感性仅降低了3倍（EC50 = 106 nM）。化合物3对LAPC4-CR细胞活力的影响与AKT信号的急性抑制相一致，包括磷酸化PRAS40的水平（图3d），PRAS40是AKT的底物，有助于mTORC1激活和癌细胞生存。相比之下，在AKT1 (WT) 表达的SkBr3乳腺癌细胞中对磷酸化PRAS40和其他信号读取的抑制效果减弱（图3d）。总体而言，化合物3对E17K突变LAPC4-CR的增加效力，与其在E17K与WT AKT1和AKT2之间的热稳定性、效力和滞留时间的增加相一致（图2）。

为支持体内研究，作者开发了氟代水杨醛化合物4（图3e），这是化合物2的衍生物，具有改善的药代动力学和基于滞留时间的选择性。化合物4对E17K突变的LAPC4-CR细胞相较于SkBr3细胞表现出更高的效力（图3f）。

图3：抑制AKT1 (E17K)介导的信号传导与癌细胞增殖。c, 用ARQ092或化合物3处理LAPC4-CR或SkBr3细胞72小时，随后评估细胞活力。d, 用ARQ092或化合物3处理LAPC4-CR和SkBr3细胞2小时，随后裂解并进行免疫印迹分析（加载对照：总AKT1 (tAKT1)，总PRAS40 (tPRAS40)，GAPDH）。e, 化合物4的结构。f, 用化合物4处理LAPC4-CR或SkBr3细胞72小时，随后评估细胞活力。

化合物的体内抗肿瘤活性

用单剂量的化合物4 (40 mg kg−1，腹腔注射) 处理LAPC4-CR肿瘤小鼠，每天两次使用化合物4 (30 mg kg−1) 显著阻止了LAPC4-CR肿瘤的生长（图4a），确认了AKT1 (E17K)（以及可能的WT AKT1）的共价抑制可以在小鼠中介导抗肿瘤效果。口服ARQ092（100 mg kg−1）在LAPC4-CR异种移植模型中也显示出疗效。然而，相较于化合物4，ARQ092的耐受性较差，并导致显著的体重下降。此外，ARQ092在对无肿瘤小鼠以50或100 mg kg−1剂量给药时引起血糖水平迅速升高。相比之下，化合物4 (30 mg kg−1) 对血糖无影响（图4b），这与其对AKT2降低的效力一致。在同源E17K突变的乳腺癌模型（HBCx-2患者来源的异种移植）中，化合物4也显示出显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制效果（20 mg kg−1时为75%，30 mg kg−1时为96%，图4c）。

图4：化合物4的体内抗肿瘤活性。a，携带LAPC4-CR肿瘤的雄性小鼠被随机分为对照组（n = 10）或化合物4治疗组（30 mg kg−1，每日两次，腹腔注射，n = 12）。按方法部分所述，测定肿瘤体积（绘制为平均值±标准误）和肿瘤生长抑制率（TGI）。b，雄性无胸腺裸小鼠接受单剂量的对照处理（腹腔注射）、化合物4（30 mg kg−1，腹腔注射）、对照（口服）或ARQ092（100或150 mg kg−1，口服），并在给药后0、1、2、4、8和24小时测量血糖水平（n = 5，平均值±标准差）。c，携带HBCx-2肿瘤的雌性小鼠被随机分为对照组或化合物4治疗组（20或30 mg kg−1，每日两次，腹腔注射，n = 8）。

“新型锌螯合物”的形成导致了对AKT1 (E17K)的持久抑制

作者获得了AKT1 (E17K)与化合物3复合物的2.2 Å分辨率晶体结构，显示了水杨醛与Lys17之间的亚胺键（图5a）。此外，还观察到一个四价金属离子密度，该离子通过酚羟基的氧原子和亚胺氮原子与水杨醛亚胺结合，同时还与激酶结构域活化环中的Cys296和Cys310相互作用。作者初步鉴定该金属离子为Zn²⁺，可能源自结晶缓冲液中的微量污染物，其特征性四面体几何结构和键长支持了这一推测。确实，有研究显示简单的水杨醛亚胺可以螯合Zn²⁺，后者在蛋白质结合位点中经常与半胱氨酸和组氨酸配位。在结晶过程中添加硫酸锌（2倍当量）后，作者获得了一个2.1 Å分辨率的结构，重复了相同的结合构象，且金属和配体的电子密度及B因子有所改善，表明了化学计量的Zn²⁺配位（图5b）。AKT1 (E17K)与化合物4复合物的结晶生成了1.9 Å分辨率的结构，显示了类似的Zn²⁺配位构象（图5c）。

作者通过在过量ARQ092存在下稀释预形成的AKT1 (E17K)–化合物3共价复合物，评估了Zn²⁺对停留时间的影响。加入ZnSO₄使共价复合物几乎不可逆，而在无金属条件下，复合物的解离半衰期为130分钟（图5d）。ZnSO₄对化合物3从AKT1 (E17K, C296/310A)解离的动力学没有影响。

作者使用细胞热迁移分析测试Zn²⁺结合是否会在细胞中稳定AKT1(E17K)–化合物3复合物。用化合物3和细胞可渗透的螯合剂TPEN（与Zn²⁺的结合亲和力为飞摩尔级）共同处理细胞3小时，相对于单独使用化合物3处理，显著降低了FLAG–AKT1 (E17K)的稳定性（图5e）。在没有TPEN的情况下评估缺乏与Zn²⁺螯合相关关键半胱氨酸的FLAG–AKT1 (E17K, C296/310A)的热稳定性时，也观察到类似的效果（图5e）。综合来看，这些数据强烈表明，Cys296和Cys310的金属螯合作用在细胞中稳定了FLAG–AKT1 (E17K)与化合物3形成的共价复合物。

因此，在细胞中，化合物3对AKT1 (E17K)的Lys17的共价修饰通过Cys296/Cys310依赖性招募Zn²⁺，形成一个稳定的螯合物。这种“新型锌螯合物”的组装导致了对AKT1 (E17K)的持久抑制，而不是对WT AKT1或AKT2的抑制。

图5：结构分析揭示了Zn²⁺螯合在抑制AKT1 (E17K)中的作用。  a. 在未添加Zn²⁺的条件下，共结晶的AKT1(E17K)–3配体的电子密度图。b. 在添加ZnSO₄（2倍当量）的条件下，共结晶的AKT1(E17K)–3配体的电子密度图。c. 分辨率为1.9 Å的AKT1(E17K)与水杨醛4（灰色）结合的共晶结构，PDB代码：8UW9。d. 纯化的AKT1突变体（1 µM）在ZnSO₄（5 µM）或EDTA（5 mM）存在下与化合物3（5 µM）作用15分钟。在加入ARQ092（50 µM）并在37°C持续孵育，以启动共价复合物的解离，使用质谱法确定AKT1的修饰百分比。e. 稳定表达FLAG–AKT1突变体的BEAS-2B细胞在DMSO或TPEN（10 µM）处理条件下与化合物3（2 µM）作用3小时。

总结

AKT1 (E17K)是多种癌症中的常见突变，常导致AKT通路过度激活。研究团队开发了结构导向的、基于水杨醛的共价抑制剂，这些抑制剂能特异性与AKT1 (E17K)突变的Lys17结合，形成一种特殊的可逆共价连接物。此外，这种连接物还能与内源性Zn²⁺结合，进一步提高抑制剂与AKT1 (E17K)的结合稳定性和选择性，从而避免了抑制AKT2引发的高血糖等不良反应。