靶向ADCC：发掘NK细胞癌症治疗的潜能

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抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是一种有效的细胞毒性机制，主要通过自然杀伤（NK）细胞介导。当特异性抗体结合到靶向细胞膜上以后，免疫细胞通过该反应诱导细胞死亡。这是抗体限制和控制感染的几种主要机制之一。

抗体和免疫细胞的相互作用通过一个受体家族发生：Fc受体（FcR）。在人类中，IgG的FcR家族（FcγR）由6个受体组成：FcγRI/CD64、FcγRIIa/CD32a、FcγRIIb/CD32b、FcγRIIc/CD32c、FcγRIIIa/CD16a和FcγRIIIb/CD16b，其中CD16a主要负责触发NK细胞介导的ADCC。因此，对CD16a作用机制的了解，有助于我们通过改善单克隆抗体最大限度地发挥NK细胞的潜力，从而扩大癌症免疫治疗的范围。

NK细胞是一种天然的淋巴细胞，能够非常有效地破坏应激细胞，如病毒感染或肿瘤转化细胞。通常情况下，ADCC效应主要通过结合FCR的抗体激活NK细胞，NK细胞膜上最具特征的FcR就是FcγRIII（CD16），其中NK细胞主要表达CD16a，而CD16b仅限于中性粒细胞。人类NK细胞分为两个主要亚群：CD56^bright和CD56^dim。CD56^brightNK细胞是强有力的细胞因子产生者，但缺乏CD16a；而CD56^dim具有高度的细胞毒性，表达CD16a。

当通过CD16a识别IgG调理的靶点时，NK细胞就会释放不同的细胞毒性分子，从而引发靶细胞的死亡。这种机制依赖于免疫突触的形成和含有穿孔素和颗粒酶的溶解颗粒的脱颗粒。除了脱颗粒外，NK细胞还可以通过将靶死亡受体（如DR4、DR5或Fas）与其死亡受体配体（如FasL和TRAIL）结合来清除靶细胞。

CD16a是一种跨膜受体，具有短的C-ter胞质尾，并具有两个细胞外Ig样结构域。它的细胞内部分不具有任何信号成分，因此，为了传递信号，它需要两条带有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的信号链。

CD16a与IgG的CH2以1:1的方式相互作用，其中CH2上的N297位的 N-聚糖链在这种相互作用中也起着关键作用。因此，不仅氨基酸序列，其聚糖组成都可以极大地影响CD16a对Fc的亲和力，从而影响ADCC的效力。

CD16a在其细胞质尾部不具有任何ITAM结构域，因此需要两条含有ITAM结构域的细胞内链串联的帮助，CD3ζ和FcϵRIγ。CD16a结合后，属于Src家族的激酶Lck被激活，并磷酸化CD3ζ和/或FcϵRIγ的ITAM结构域。磷酸化的ITAM允许来自Syk家族的激酶招募和磷酸化，例如Syk和ZAP-70，它们反过来负责后续的信号传导。在它们的底物中，PI3K是高度相关的，因为它将PIP2转化为PIP3，PIP3经PLC-γ处理后释放IP3和DAG。DAG激活PKC家族，这有助于触发脱颗粒。IP3诱导钙从内质网释放，这种钙内流是ADCC触发的主要信号之一，也导致核内NFAT易位，诱导其靶基因的转录。CD16a参与激活的其他途径也有助于ADCC，例如ERK2 MAPK途径。

CD16a依赖性NK细胞杀伤后，CD16a迅速下调。CD16a脱落的机制之一是由去整合素和金属蛋白酶17（ADAM17）介导的，后者在NK细胞上表达。ADAM17对CD16a的切割发生在顺式结构中，这意味着表达ADAM17的NK细胞不能在另一个NK细胞上诱导CD16a脱落。激活后CD16a下调的另一个机制是内化，这不仅发生在CD16a上，也发生在其他细胞内信号成分上，如CD3ζ、ZAP-70和Syk。

细胞因子

提高ADCC活性的一个简单方法是用促炎细胞因子刺激NK细胞。NK细胞移植已在多个临床试验中成功进行，例如通过输注细胞因子诱导记忆样（CIML）NK细胞，最常用的细胞因子组合包括IL-12、IL-15和IL-18。CIML NK细胞比传统NK细胞表达更多的IFN-γ，对白血病细胞和原发性急性髓系白血病（AML）母细胞显示出优越的细胞毒性。

IL-12会增加NK细胞产生IFN-γ和TNF-α，在一项I/II期临床试验中，西妥昔单抗与IL-12联合应用于无法切除或复发的头颈部鳞状细胞癌患者。与无进展生存期（PFS）小于100天的患者相比， PFS大于100天的患者NK细胞在体外具有更高的ADCC活性。

IL-15是NK和CD8+T细胞生存和功能所必需的细胞因子。N-803是一种突变的N72D IL-15超激动剂，在临床前模型和临床试验中显示出增强的NK细胞体外和体内活性。此外，它还增加了NK和CD8+T细胞的数量。

抑制ADAM17

ADAM17是激活后CD16a下调的主要驱动因素。改善NK细胞ADCC的一种策略是通过靶向ADAM17来防止CD16a脱落。研究发现，对NK细胞中使用CRISPR/Cas9技术敲除ADAM17，显示出更好的IFN-γ生成和体内外ADCC活性。然而，也有研究显示，阻断ADAM17降低了NK细胞的存活率以及CD16a介导的连环杀伤，细胞无法与靶细胞分离，阻碍其运动到另一个靶细胞。

总之，ADAM17抑制的益处尚不清楚，结果也有争议。这一策略是否能够成功，有待于一项正在进行的临床试验（NCT04023071）结果，该试验将评估携带不可切割CD16a的iPSC衍生NK细胞在AML和B细胞淋巴瘤中的应用。

工程化抗体

抗体的Fc部分进行工程化改造，可以增加Fc对CD16a的亲和力，并随后改善ADCC。一些突变非常流行，例如，所谓的GASDALIE，由Fc中的4个替换组成：G236A/S239D/A330L/I332E。该突变显示对CD16a的亲和力显著增加，而CD32b亲和力几乎没有增加。

另一个突变称为突变体18（F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L），ADCC显著增加。这些突变现已作为抗HER2抗体margetuximab进入临床，并在I期治疗各种HER2阳性癌时显示出良好的效果。

此外，抗体Fc N-聚糖的糖工程化有望增加对CD16a的亲和力。研究最多的糖修饰是去糖基化，例如去岩藻糖修饰。这种修饰导致与CD16a的结合增加，ADCC改善。这项技术已被用于抗CD20抗体obinutuzumab。

NK细胞接合器

除了工程化抗体之外，还可以研究抗体的形式。基于双特异性T细胞接合器（BiTE）策略的成功，为NK细胞开发了一种类似的形式，即所谓的双特异性杀伤细胞接合器（BiKE）。BiKE由两个scFv通过连接序列组成，一个单链抗体靶向CD16a，另一个靶向肿瘤抗原。

此外，还有三特异性杀伤细胞接合器（TRiKE），有2种肿瘤抗原与CD16a一起被靶向，或者添加IL-15代替第三种单链抗体。这种结构的使用允许NK细胞重新定位到肿瘤细胞，并导致针对靶细胞的强大ADCC作用。

AFM13是一种针对CD16a和CD30的双特异性抗体，目前处于临床Ⅱ期，用于治疗外周T细胞淋巴瘤、转化型蕈样变性和霍奇金淋巴瘤。在一项治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤的Ib临床研究中，AFM13与pembrolizumab的联合治疗产生了88%的客观反应率，总反应率为83%。GTB-3550是一种CD16/CD33/IL-15的TRiKE形式，目前正在进行多种类型白血病的I/II期试验研究（NCT03214666）。

调节代谢途径

代谢失调是肿瘤微环境中免疫抑制的关键驱动因素，许多研究已经表明，免疫细胞代谢对其功能至关重要。最近，一些代谢药物在增强NK细胞活性方面显示出有希望的结果。二甲双胍，被证明可以增加免疫细胞配体的表达，尤其是ICAM-1的表达。ICAM-1是一种整合素，可以调节淋巴细胞细胞内信号，包括NK细胞。二甲双胍与UCB联合使用扩增NK细胞在体外和体内显示出更高的肿瘤细胞清除率。

此外，另一种策略是直接调节NK细胞代谢。cMyc是调节小鼠NK细胞糖酵解和氧磷代谢机制的关键因子，缺乏cMyc会导致NK细胞反应受损。糖原合成酶激酶-3（GSK3）可介导小鼠NK细胞中cMyc的降解。与此一致，在AML患者的NK细胞中检测到GSK3过度表达，并与针对AML细胞的细胞毒性受损有关，GSK3抑制剂可恢复这些NK细胞的活性。目前，一些临床试验正在评估GSK3抑制剂LY2090314对实体癌和血液癌的疗效（NCT01632306、NCT01287520和NCT01214603）。

靶向CD16a可能有助于解决当前癌症免疫治疗治疗抗体的一些现有局限性，从而最大限度地提高ADCC促进更有利临床结果的潜力。然而，依然有一些未解决的问题亟待回答：

• 靶向CD16a优于其他NK细胞激活受体的优势是什么？

• 激活NK细胞触发ADCC的最有效方法是什么？激活NK细胞能在多大程度上触发适应性免疫以增强总体抗肿瘤活性？

• NK细胞接合器能促进NK细胞在肿瘤部位的归巢和持续存在吗？

• 肿瘤内CD16a+NK细胞和巨噬细胞的表达水平如何？由于CD16a在NK细胞和巨噬细胞上都有表达，因此我们有必要了解当特异性靶向CD16a时，不同免疫细胞类型相对于不同肿瘤实体的贡献。

• CD16a脱落对ADCC活性及其临床疗效的影响是什么？用不可脱落的CD16改造细胞产品有好处还是坏处？

• 一线治疗后NK细胞受体或靶向肿瘤抗原的下调是否会影响NK细胞接合器疗法的疗效？

• NK细胞激活剂的临床疗效如何受到患者年龄、治疗开始时的健康状况和预处理方案等参数的影响？

自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。通过CD16a的ADCC作用是NK细胞发挥效应器功能的主要机制之一。因此，对CD16a的生物学的深入了解有助于我们找到增强ADCC作用的策略，从而提高NK细胞的抗肿瘤活性。

参考文献：

1.From CD16a Biology to Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Improvement. Front Immunol.2022; 13: 913215.

2. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol.2022 Nov;43(11):932-946