基因递送的多面手：慢病毒载体

慢病毒是以HIV-1为基础改造而来的一种病毒载体。在数十年的应用中，慢病毒载体的生物安全性和有效性不断被提升，目前已经成为体内外生物实验中一种功能非常强大的基因递送工具。

在基因递送方面，慢病毒载体拥有诸多独特的优势：稳定持久表达、可感染多种类型细胞、可携带大片段基因、免疫原性比较低等。无论是基础科研还是临床应用，慢病毒载体都具有非常广泛的应用前景。

慢病毒的应用场景

目前慢病毒载体主要应用在以下几个方面：

细胞基因治疗（截止目前，已上市的CAR-T产品有9款采用了慢病毒载体递送CAR基因）
基因表达调控（过表达、RNA干扰研究等）
基因编辑（CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选、基因敲除、敲入、点突变、基因激活/抑制）
稳转细胞株构建
活体细胞成像追踪
转基因动物

图1 慢病毒载体的主要应用方向

应用案例

案例1：用慢病毒载体进行基因过表达，构建稳转细胞株，研究葡萄糖激酶在前列腺癌（PCa）中的作用¹

细胞代谢在肿瘤进展中起着关键作用，靶向癌症代谢可能有效地杀死癌细胞。本文旨在研究葡萄糖激酶在前列腺癌中的作用，并确定PCa治疗的关键靶点。

实验设计和主要研究结果：

癌症基因组图谱（TCGA）数据库和在线工具评估结果显示ADP依赖型葡萄糖激酶（ADPGK）是唯一一种在前列腺腺癌（PRAD）中上调并预测较差总生存（OS）的葡萄糖激酶。临床样本分析显示，与非PCa组织相比，ADPGK在PCa组织中显著上调。
ADPGK过表达促进了PCa细胞的增殖和迁移，而敲低ADPGK则抑制了恶性表型。
代谢组学、蛋白质组学以及ECAR和OCR测试揭示了ADPGK显著加速了PCa的糖酵解。
ADPGK与丙酮酸激酶C（ALDOC）结合，通过AMP激活蛋白激酶（AMPK）磷酸化促进糖酵解。

图2 用于ADPGK过表达的慢病毒结构示意图及ADPGK过表达结果。

案例2：用慢病毒载体递送RNA干扰工具，研究脯氨酸羟化酶结构域蛋白在调节心肌细胞钙水平中的功能²

由于高氧消耗，心肌细胞对环境中的氧气极为敏感。脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（PHD2）是一种氧气传感器，对细胞缺氧适应性至关重要。近年来的研究发现，PHD抑制剂（PHIs）和针对PHD2的小干扰RNA（PHD2shRNA）可以在不影响细胞能量水平的情况下激活AMPK，将细胞缺氧信号转化为能量代谢信号，使细胞产生能量保护反应，并显著提高细胞对缺氧的抵抗力。研究还发现，信号分子钙（Ca2+）在响应缺氧的AMPK信号通路激活中发挥着重要作用。然而，PHD活性如何增加细胞内Ca2+水平并激活AMPK信号通路的分子机制仍然不清楚。

实验设计和主要研究结果：

确认PHIs 诱导心肌细胞中的钙释放。
PHD2 在心肌细胞中激活肌浆网通道辅助蛋白 CaMKⅡ。用shRNA干扰技术敲低心肌细胞中PHD2，Western blot证实了PHD2的沉默。与对照细胞相比，沉默PHD2显著增加了CaMKⅡ的磷酸化。
Ca²⁺ 在心肌细胞中介导 PHI 刺激引起的 AMPK 激活。肌浆网通道抑制剂瑞安诺丁显著降低了PHI处理诱导的与Ca²⁺相关的荧光强度。慢病毒介导的RyR2特异性shRNA显著降低了RyR2在mRNA水平上的表达。此外， IP3R阻断剂2-APB预处理或慢病毒介导的IP3R特异性shRNA均未显著影响PHI处理诱导的P-AMPK水平。2-APB预处理对PHI诱导的Ca²⁺荧光也无显著影响。这些结果表明，PHI诱导的钙释放和AMPK激活主要由肌浆网通道而非IP3R通道调节。
CaMKⅡ介导PHI诱导的钙释放和AMPK激活。PKA不参与PHI/Ca²⁺/AMPK信号通路，而CaMKⅡ在PHI/Ca²⁺/AMPK信号通路中发挥着重要作用。
TRPA1介导PHI/Ca²⁺/AMPK信号通路的激活。TRPA1抑制剂HC030031预处理显著抑制了PHI诱导的P-AMPK和P-CaMKⅡ增加，并显著减少了PHI诱导的Ca²⁺荧光。PHD2 shRNA组中TRPA1蛋白水平显著高于对照组。这些结果强烈表明TRPA1在PHD诱导的Ca²⁺释放途径中发挥着至关重要的作用。

图3 慢病毒介导的特异性shRNA对 PHD2、RyR2和IP3R的敲低效果。

案例3：用慢病毒介导的基因编辑技术研究穿透内耳血迷路屏障（BLB）的靶点³

内耳疾病是一种导致全球超过 15 亿人听力丧失的疾病。然而，内耳毛细血管表面存在血迷路屏障（BLB），由于渗透性低，限制了大多数药物化合物从血流进入内耳组织，极大地阻碍了全身药物预防和干预的有效性。本研究报告了一种在 BLB 上表达的新型受体低密度脂蛋白受体相关蛋白 1 (LRP1)，它可以作为穿梭治疗药物跨越这一屏障的潜在靶标。

实验设计和主要研究结果：

LRP1在小鼠和猪的耳蜗细胞中广泛表达，尤其在BLB区域和目标细胞中。
通过靶向LRP1的配体肽IETP2，可以将不同的小分子如荧光染料、抗氧化药物和MRI造影剂等传递到内耳。这表明LRP1可能是一个有效的靶点，用于开发非侵入性和针对性的药物递送策略，以提高内耳疾病的治疗效果。
LRP1在细胞内吞作用中也起着关键作用。研究表明，IETP2肽与LRP1结合后可以被LRP1阳性细胞内化，并且这种内吞作用依赖于LRP1的表达。通过使用CRISPR/Cas9技术敲低LRP1基因，进一步证实了LRP1在IETP2内吞中的关键作用。

这些发现为开发新的治疗策略提供了重要的基础，可能有助于未来内耳疾病的诊断和治疗。通过利用LRP1的介导作用，研究人员可以探索将治疗药物更有效地传递到内耳，从而提高治疗效果并减少副作用。

图4 用于敲低LRP1的慢病毒载体结构和sgRNA。

图5 LRP1的敲低效果。

派真生物有幸为以上三项研究提供慢病毒。

案例4：慢病毒递送高灵敏度的报告基因Akaluc用于追踪胶质瘤的体内生长、侵袭和转移过程⁴

使用非侵入性生物发光成像（BLI）对肿瘤生长进行纵向追踪是研究体内癌症模型的关键方法。Akaluciferase（Akaluc）是一种新的BLI系统，其信号强度高于标准的萤火虫荧光素酶（Fluc）。本文设计了一种慢病毒载体，用于在胶质瘤细胞系中表达Akaluc，追踪胶质瘤的体内扩张过程。

实验设计和主要研究结果：

Akaluc和Fluc报告基因的设计和灵敏度比较。用表达Venus-Akaluc或Venus-Fluc融合蛋白的慢病毒载体转导人GBM细胞系U87MG和小鼠高级别胶质瘤细胞系GL261，结果显示病毒载体转导对胶质瘤细胞的增殖率没有显著影响，表达Akaluc的细胞比表达Fluc的细胞的BLI信号强大约10倍。
颅内移植表达Akaluc的胶质瘤细胞产生超过Fluc 100倍的BLI信号。将GL261-Venus-Akaluc和GL261-MSCV-Fluc胶质瘤细胞颅内植入到同系的C57BL/6小鼠中，在所有时间点，Venus-Akaluc组的BLI信号显著高于GL261-Fluc组。