2024 ESMO | 张勇教授深入解读乳腺癌分子生物标志物最新研究进展

III期DB-06研究旨在探索T-DXd与研究者选择的单药化疗对激素受体阳性（HR+）/HER2低表达（IHC 1+或2+/ISH-）或HER2-ultralow（IHC 0伴有膜染色）晚期乳腺癌的疗效和安全性。今年美国临床肿瘤学会（ASCO）公布的研究结果显示，T-DXd能为HER2低表达和HER2-ultralow人群带来一致的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）获益。进而，本次ESMO大会披露了DB-06研究进一步的病理数据的。

该项报告显示意向治疗（ITT）人群中无论入组患者标本源自原发灶/转移灶、活检/手术切除，以及不同HER2表达状态，T-DXd组相比化疗组均具有与总人群一致的PFS（BICR）获益趋势。地方实验室诊断为HER2低表达的病例和中心实验室的一致性为77.8%。由于地方实验室并未对IHC 0中是否有细胞膜染色进行区分，故无法获得HER2-ultralow的一致性数据。在地方实验室判读为IHC 0的349例患者中，有64%的患者在中心实验室重新判读为HER2低表达（24%）或HER2-ultralow（40%）^[1]。

图1. DB-06研究中地方和中心实验室的HER2检测一致性评价

该研究结果意味着一些HER2零表达（IHC 0）乳腺癌病例实际上为HER2低表达或HER2-ultralow，这部分患者通过重新阅片、重新活检、重新检测，可能被重新判定为HER2低表达或HER2-ultralow，从而获得T-DXd治疗的机会。同时，仍存在部分地方和中心实验室检测结果不一致的病例，这是否与空间异质性相关（地方实验室和中心实验室检测的样本是否来自同一蜡块），或是由于不同的检测平台和检测抗体所导致，抑或由于病理医生判读的差异所导致，期待这部分病例的病理数据进一步公布，为临床病理医生更加精准地诊断出HER2低表达和HER2-ultralow乳腺癌提供有力的循证依据。

DB-04研究纳入经过1-2线化疗的晚期HER2低表达（IHC 1+和IHC 2+且ISH-）乳腺癌，既往研究结果显示，T-DXd在HR+和三阴性乳腺癌（TNBC）中均带来PFS和OS获益。一项研究进一步分析了DB-04研究中HER2低表达乳腺癌患者不同的病理学特征，如HER2表达和突变、DNA损伤反应（DDR）或细胞增殖、BRCA1/2或同源重组修复（HRR）基因改变、以及肿瘤微环境与T-DXd疗效之间的关系^[2]。

研究结果显示，在不同的HER2 IHC状态、HER2基因表达水平或HER2突变状态下，T-DXd的临床获益均无统计学差异，且显著优于医生选择的化疗（TPC）。相较于HER2基因表达较低的患者，在HER2基因表达水平较高的患者中，特别是在T-DXd组中，未观察到显著的cORR改善和PFS延长的获益趋势。无论DDR、细胞增殖基因表达特征、BRCA1/2和HRR基因改变状态、肿瘤微环境状态如何，T-DXd相较TPC均带来一致的临床获益。

图2. DB-04研究中根据HER2 IHC状态和HER2基因表达水平的PFS率

该研究结果表明，在HER2低表达患者中，T-DXd的疗效并不受肿瘤异质性的影响。结合既往研究结果显示，T-DXd可克服常见的肿瘤耐药机制，意味着在临床上一旦检测出HER2表达，便可考虑使用T-DXd治疗。然而，采用当前标准的HER2 IHC评分来区分0和1+的一致性较差，这种误判在真实世界中可能导致许多患者错失接受T-DXd治疗的机会。为更精准判读HER2低表达乳腺癌目前仍需解决如下一系列问题：是否能够设置可以区分IHC 0和IHC非0的参考标准？IHC 0 vs 1+染色阈值对预分析因素的依赖性有多大，如冷缺血时间、样本固定时间，以及白片保存时间？这是否会影响潜在预测性治疗阈值的有效性？各实验室之间的HER2 IHC抗体敏感性或其他分析因素的差异有多大？组织异质性的影响有多大，以及应该使用多少样本来确定IHC非零染色≥10%^[3]。

一项研究提出了一种从无细胞小RNA（smRNA）推断ER和HER2表达的新方法，这些smRNA包括寡非编码RNA。这些smRNA通过胞外囊泡和脂蛋白复合物的结合被保护，因此在血液中能够被稳定且主动分泌。该方法使用smRNA作为肿瘤转录组的替代物，并结合了自动化和CLIA认证的实验室工作流程，可以从1毫升血浆中推断乳腺癌患者的ER和HER2表达，目前正在通过增加样本数量来改进模型^[4]。

一项研究收集了来自DESTINY-PanTumor02研究和商业提供数据集的不同肿瘤类型的组织图像，这些肿瘤组织经过染色以显示HER2蛋白水平。三位病理医生审阅了这些图像，并分别使用ASCO/CAP乳腺癌评估标准、ASCO/CAP胃癌评估标准，以及Fader等人临床研究中针对子宫内膜癌的评估标准来分析HER2水平（IHC 3+/2+/1+/0）^[5]。

研究结果显示，在使用乳腺癌和胃癌评估标准的不同实体瘤病例中，三位病理医生针对IHC 3+和IHC 0病例的判读一致性（PPA）较高，而针对IHC 2+和IHC 1+病例的PPA较低。在使用子宫内膜癌和胃癌评估标准的子宫内膜癌病例中，对于所有HER2表达水平，三位病理医生的PPA均缺乏一致性。在IHC 3+和IHC 2+病例中，阴性预测一致性（NPA）最高，而在IHC 1+和IHC 0病例中较低。

图3. 不同肿瘤类型中，使用不同评估标准的病理医生间的一致性

在所有HER2表达水平中，病理医生之间的PPA在IHC 3+和IHC 0病例中最高；而在IHC 2+和IHC 1+病例中最低，所有评估标准在不同肿瘤类型之间观察到显著的病理医生间的PPA差异。在不同肿瘤类型中，当按照胃癌和乳腺癌评估标准进行HER2评分时，大多数病理医生之间至少存在中等程度的一致性。而使用子宫内膜癌评估标准针对子宫内膜癌病例进行HER2评分时，病理医生之间分别存在中等、微弱和轻度的一致性。

该研究表明，在评估不同类型实体瘤的HER2表达水平时，需要提高对最佳评分标准的认识，以确保能够识别出从T-DXd治疗中获益的患者。

一项研究开发了定量连续评分（QCS），一种针对免疫组化的计算病理学方法，基于完全监督的深度学习算法，自动分割肿瘤细胞及其亚细胞区室。基于HSD染色分离模型，QCS为每个肿瘤细胞的所有细胞区室提供DAB强度值，从而产生新的评分方法。本研究旨在考察通过质谱（MS）测量的靶蛋白水平与通过免疫组化获得的视觉或数字评分之间的关联^[6]。

在对103个PDX样本的分析中，观察到H评分与QCS中位膜光密度之间存在强相关性。此外，QCS在较高值时表现出更广的动态范围。在各靶点之间，视觉评分在较低的蛋白浓度下达到饱和（H评分 >270），而QCS则未达到，表明使用数字评分方法可以扩展免疫组化检测的动态范围。从质谱估算每个细胞的蛋白数量与IHC QCS读数存在强相关性，建议可以从IHC染色切片中潜在估算每个细胞的蛋白数量。相较于视觉病理评估，QCS扩展了免疫组化评分的动态范围。增强的免疫组化定量化使得利用MS引导免疫组化检测具有开发的潜力，包括优化其动态范围。

图4. H评分和QCS读数与MS的相关性

一项研究收集了51例接受T-DXd治疗的转移性乳腺癌患者的样本，并分析了其中20例患者（39.2%）的原发灶肿瘤样本，13例患者（25.5%）的转移灶活检样本，以及18例患者（35.3%）的原发灶和转移性灶活检样本。研究者使用QuPath Qymia分子分区法的定量免疫荧光技术确定高灵敏度HER2（HS-HER2）。病理医生圈出了每个活检样本中受到关注的区域进行测量，然后利用液相色谱-串联质谱校准的细胞系标准曲线，在T-DXd治疗前的样本中测量HER2蛋白的含量。该研究评估了T-DXd治疗前最近采集的样本中HS-HER2与下一次治疗时间（TTNT）和OS的关联^[7]。

在所有患者中，HS-HER2与TTNT和OS显著相关。在HER2阳性和HER2阴性转移性乳腺癌患者中，HS-HER2每增加1个和5个单位与TTNT之间观察到了显著的相关性，HER2 IHC评分与HS-HER2值之间观察到强烈的正相关性（r=0.77, p<0.001）。这项研究结果意味着，在治疗前进行的HS-HER2定量评估能够预测T-DXd在转移性乳腺癌（HER2阳性和HER2阴性）中的临床结果。

图5. 根据HS-HER2四分法下T-DXd治疗的OS

一项研究评估了HER2表达的频率及其预后影响，并对真实世界患者中ERBB2基因组变异与肿瘤的大量分子特征分析之间的关联进行了深入分析。针对多种肿瘤类型进行了HER2 IHC检测（使用4B5抗体），并对DNA（592基因或全外显子组）和RNA全转录组进行了NGS测序。该研究发现，ERBB2变异与HER2低表达肿瘤之间存在显著关联。在一些不常被检测的肿瘤类型中，观察到ERBB2高频率变异。在这一患者群体中，HER2低表达病例的中位OS优于HER2零表达患者。然而，在排除乳腺癌和胃癌后，这一差异不再显著^[8]。

一项研究在229例乳腺癌和胃食管癌患者中，通过HER2免疫组化和荧光原位杂交确定了HER2状态。在乳腺癌和胃食管癌样本中，确定了基于HER2阳性标准的HER2-mRNA和蛋白质的截断值，并将该数值应用于其他肿瘤。此外，在所有肿瘤类型中检测了ERBB2扩展和突变的情况^[9]。研究结果显示，HER2 mRNA和蛋白质水平与来源于IHC和FISH的HER2阳性和HER2阴性乳腺癌及胃食管癌之间显示出显著关联。在HER2蛋白阳性组中，3.7%的肿瘤伴有ERBB2突变，44%伴有扩增。在HER2 mRNA阳性组中，13%伴有ERBB2突变，36%伴有扩增。这项研究表明HER2 mRNA和蛋白质定量在识别各种肿瘤中HER2阳性患者具有一定的实用性，病理医生在识别和选择HER2靶向治疗患者的临床试验中可考虑采用这些生物标志物。

图6. 基于IHC/FISH检测为HER2阳性/阴性乳腺癌/胃食管癌肿瘤病例的HER2 mRNA和蛋白表达情况

一项回顾性研究筛选并纳入了367例HR+/HER2-转移性乳腺癌患者，评估了组织和ctDNA NGS在PIK3CA、AKT1、PTEN以及ESR1、BRAF和NTRK基因上的一致性^[10]。研究结果显示，PIK3CA和AKT1的阳性一致性最高，ESR1为中等，PTEN较低。当最大VAF（变异等位基因频率）较低时，ctDNA的敏感性较低。ctDNA和组织的一致性在不同的基因突变中有所不同。同时对ctDNA和组织进行NGS可以提高HR+/HER2-转移性乳腺癌患者中可靶向突变的检测率。在ctDNA中检测到更多的ESR1突变，而在组织中检测到更多的PTEN突变，这可能反映了ESR1突变在内分泌治疗后的空间异质性，以及当前基于ctDNA panel无法检测PTEN拷贝数缺失的局限性。临床医生应考虑常规进行基于ctDNA和组织的NGS检测，或者当第一次检测为阴性时（特别是当ctDNA最大VAF较低时），立即对ctDNA或组织进行NGS检测。

一项针对TNBC的研究使用具有PI3K/AKT通路基因改变和通路正常的临床前模型，评估了AKT抑制剂对紫杉醇疗效的影响。研究结果显示，基线时PI3K/AKT通路激活在基因改变和正常的TNBC细胞系中存在差异。在体内联合使用Capivasertib和紫杉醇对PI3K/AKT通路基因改变的肿瘤模型显示出治疗优势^[11]。Capivasertib延缓了PI3K/AKT通路改变和通路正常的紫杉醇耐药细胞的生长。Capivasertib在紫杉醇耐药、PI3K/AKT通路改变和正常的TNBC细胞中诱导了凋亡，并减少了这些细胞的PI3K/AKT通路激活。短期紫杉醇治疗对紫杉醇耐药TNBC细胞的PI3K/AKT通路效应因子的影响表现出变异性。在体内，Capivasertib与紫杉醇联合治疗在PI3K/AKT基因改变的TNBC异种移植模型中增加了肿瘤生长抑制。在体外，Capivasertib对紫杉醇耐药细胞的治疗延缓了其生长，并在PI3K/AKT通路改变和正常的TNBC细胞中诱导了凋亡。并且在体外紫杉醇治疗后，PI3K/AKT通路改变和正常的的TNBC细胞系会产生紫杉醇耐药细胞，这些细胞中PI3K/AKT通路效应因子的调节具有不稳定性。

一项纵向研究分析了24例携带BRCA1/BRCA2致病变异并接受PARP抑制剂治疗的晚期乳腺癌患者的血液和可用肿瘤样本^[12]。研究结果显示，RAD51‑IF肿瘤检测将11/12(92%)个可用的治疗前样本鉴定为同源重组修复缺失（HRD），将10/10(100%)个治疗后样本鉴定为具有同源重组修复能力(HRP)。基于ctDNA的测序发现，8/24(33%)例接受PARP抑制剂治疗的患者存在BRCA1/BRCA2突变。ctDNA panel测序分别发现1/24（4%）和2/24（8%）的患者在基线或进展时具有对PARP抑制剂的耐药机制。在1/24 (4%)  患者和7/24 (25%)患者中分别检测到BRCA1或BRCA2突变。ctDNA测序可以捕获突变和其他对PARP抑制剂产生耐药性的机制，尽管循环肿瘤细胞（CTC）的分离和培养存在挑战，但通过RAD51‑IF测试CTC中的功能性HRD是一种可行的方法。血液样本检测提供了有关HRD和PARP抑制剂耐药机制的宝贵信息，可作为对组织活检的补充检测手段。

ctDNA已成为一种新型预测和预后生物标志物，基于精准医疗领域的进步，ESMO精准医学工作组在今年更新了在常规实践中对晚期癌症患者进行NGS检测的建议。在此更新报告中，小组内部的共识已促使建议范围扩大到涵盖晚期乳腺癌患者和罕见肿瘤患者。ESMO建议对可以获得匹配疗法的转移性癌症患者进行NGS检测以识别肿瘤不可知的改变^[13]。在此项建议公布后，全球范围内NGS检测后靶向治疗和癌症免疫调节治疗（单独使用和与化疗联合使用）的使用有所增加^[14]。本次ESMO大会公布的一项研究旨在评估在分子预筛选中实施基于ctDNA的NGS测序的可行性和临床实用性。

研究结果表明，39%的患者有ESCATI-III可靶向变异，其中19%的患者有两个或更多的可靶向变异。总共有40名(6%)患者在ctDNA中检测到新的可靶向变异（其中58%的患者组织不可用，42%的患者随后在基于组织的NGS检测中得到确认），并接受了后续基因组匹配的靶向治疗，主要发生在肺癌、结直肠癌和乳腺癌(N=6,100%的患者携带PIK3CA突变)。在ctDNA中发现新的可靶向变异的患者群体中，实施基于基因组匹配的靶向治疗策略，客观缓解率（ORR）达到35%，疾病控制率（DCR）达到75%。该研究为成功应用ctDNA进行NGS检测的临床实践提供了例证，推动了对基因组匹配治疗路径以及肿瘤反应产生积极影响的可靶向变异的非侵入性识别^[15]。

图7. 不同肿瘤类型中最常见的ESCAT I-III可靶向变异

Ki-67作为乳腺癌中一项关键的生物标志物，对于HR+/HER2-乳腺癌患者的辅助治疗具有重要价值。尽管在乳腺癌领域已存在关于Ki-67免疫组化（IHC）评分的指导性建议，但目前尚未在不同病理学家之间形成一种被普遍接受的评分体系。一项研究在乳腺癌患者中进行了分析，比较了人工智能（AI）深度学习图像分析平台、图像分析监督软件以及两位独立病理学家在Ki-67评分上的差异^[16]。研究结果总体表明，基于AI的图像分析工具在Ki-67评分方面发挥了重要作用，有助于降低病理学家之间的评分差异。这些发现证实了采用AI辅助技术进行乳腺癌Ki-67分析，不仅具有显著的时间效率优势，而且能够确保高效且有效地提供Ki-67评估结果。