三优生物高表达稳定细胞株流程及案例

抗体药物的开发是一个复杂和漫长的过程，构建高表达稳定细胞株是抗体药工艺开发的起点和基础。三优生物的生产细胞株构建平台具备190+ 工业细胞株和3000+ 细胞株构建及鉴定的经验（图1和图2），具备4套商业化授权的宿主，依据600+ SOP，1200+ 国际先进仪器设备，10000+ m²，开放实验室，全程C+A级GMP环境，从而能够快速高效生产出合规的、高表达量的、高质量的、稳定性好的工业细胞株。

▲ 图1 生产工业细胞株项目数量

▲ 图2 部分项目工业细胞株高表达量

1. 稳定细胞株构建流程

生产用细胞株构建平台提供4套授权细胞株供客户选择（包括Thermo授权的Freedom CHO-S, Horizon授权的HD-BioP3 Null CHO K1，Merck授权的CHOZN与QuaCell授权的CHO-K1Q），细胞株构建经过4重筛选体系，6轮筛选过程，2轮稳定性评估，为全球客户提供快速高效、合规、高表达量、高质量、稳定性良好的生产用细胞株。细胞株构建流程包括基因优化、载体构建、细胞转染、细胞池筛选、单细胞克隆及筛选、细胞库构建和稳定性评估（图3）。平台实行严格的cGMP管理体系，仅需约2.5个月即可获得稳定高表达的高质量细胞株，表达量最高可达13 g/L。

▲ 图3 单克隆细胞株构建总体概览图

2. 三优单克隆细胞株构建案例

细胞株构建案例为IgG1单抗，细胞池构建工艺为Bulk pool，然后进行单克隆细胞株和稳定性筛选，3 L反应器筛选得到表达量高、稳定传代的细胞株，具体见下文。

▶ 2.1. 高表达细胞池构建

细胞池（Bulk Pool）构建：通过稳转的方式将带有目的基因的质粒转入宿主，利用GS筛选系统获得表达量大于2 g/L的高质量细胞池，用于后续的单克隆筛选使用。

将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体电转染进入宿主细胞内， DNA进入宿主细胞核后将会整合到宿主细胞基因组中，接下来利用Bulk pool方法筛选出高水平表达正确目的基因的细胞群。将高表达的细胞池转入摇瓶Fed-batch 培养14天，表达量最高到2.3 g/L，收样时活率均大于60%（图4）。

▲ 图4 高表达细胞池的密度、活率及表达量

▶ 2.2. 单克隆细胞株构建

单克隆筛选：细胞打印系统匹配单克隆成像仪获得数千个单克隆细胞，选用GS高表达筛选系统筛选，利用板式反应器、管式反应器、摇瓶、发酵罐等多重筛选体系，1000+ 克隆逐步淘汰选优，确保最终获得Top 4高表达的稳定的单克隆工业细胞株。

Bulk pool中每个细胞具有不同的基因整合位点、产量、拷贝数和生长速率等特点，因此需要将具有高产的、稳定的细胞个体分离出来分别培养。通常需要获得数百甚至上千的候选克隆，1000+ 克隆基于板式反应器筛选体系，采用2轮Batch和分批补料实验Fed-batch逐步淘汰至Top 10，24深孔板表达12天后表达量可达到1.4 g/L（图5）。

▲ 图5 Top 10单克隆细胞株筛选

然后将获得Top 10单克隆细胞株接种到培养基中进行F125摇瓶Fed-batch培养，定期取样，检测活细胞密度、细胞活率、表达量、糖及乳酸等代谢数据，评估单克隆细胞株在摇瓶中细胞生长、代谢及表达情况。单克隆细胞株进行17天摇瓶Fed batch培养，综合细胞生长及表达量Top 4为优选克隆，表达量最高到7.3 g/L，收样时活率均大于60%（图6，如需更多生长代谢参数，请联系三优生物）。

▲ 图6 F125摇瓶Fed-batch培养单克隆细胞的生长代谢数据

▶ 2.3. 预稳定性筛选

预稳定性筛选：从细胞株传代稳定性、细胞生长稳定性、抗体持续生产稳定性、基因序列一致性和基因拷贝数等方面对Top 4细胞株预稳定性进行超过60个PDL的评估，筛选出表达量相对偏差在30%以内的单克隆细胞株。

在克隆正式确定后，对建库细胞Top 4进行60个PDL的预稳定性评估，确保细胞库稳定性能满足商业化生产。单克隆A的PDL 8.33、PDL 11.62、PDL 22.01、PDL 32.24、 PDL 41.04、PDL 50.79和PDL 60.78各代次细胞进行摇瓶Fed batch培养，表达过程正常，各代次细胞生长趋势一致，均培养18天，收样时活率均大于70%，收样后纯化各代次蛋白质量SDS和SEC均大于95%，蛋白质量符合要求（图7，如需更多生长代谢参数，请联系三优生物）。克隆A表达量和拷贝数的相对偏差均控制在30%以内，符合标准（图8）。

▲ 图7 单克隆A预稳定性培养细胞的生长代谢数据

▲ 图8 单克隆A表达量和基因拷贝数的稳定性评估

▶ 2.4. 3 L反应器筛选

3 L反应器筛选：将最优的数个单克隆扩大培养至3 L反应器中，考察单克隆细胞的生长代谢、产量和质量数据并结合预稳定性数据筛选Top 1单克隆，为后续中试生产提供依据。

被筛选出来的克隆经过传代培养和Fed-batch，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等，选出最优的4个克隆进入生物反应器放大实验（3 L反应器）。细胞株活细胞密度最高可到25.0 × 10⁶ cells/mL，培养20天后，细胞活率仍可维持在87%，抗体表达量可达8.3 g/L，代谢参数（葡萄糖、乳酸、pH铵离子、谷氨酰胺、谷氨酸）均在正常工艺控制范围（图9，如需更多生长代谢参数，请联系三优生物）。3 L反应器中不同Fed-batch时间的抗体的SEC、NR-CE和CEX等数据均在质量标准范围内（表1，如需更多质检检测数据，请联系三优生物）。

▲ 图9 3 L反应器中单克隆A的生长代谢数据

▼ 表1 检测3 L反应器中不同Fed-batch时间的抗体质量数据

3. 三优细胞株构建优势和服务亮点

三优生物细胞株构建团队成员项目经验丰富，具有3000+ 细胞株构建及鉴定的经验，种类涵盖单抗、双特异性抗体、三特异性抗体、融合蛋白等。目前，引入4套商业化授权CHO细胞株，具有特色GSV0质粒完美适配宿主，引进CHO和TnT转座子完美结合技术，2套单克隆打印及成像系统提供双重保障，实行cGMP标准，最快仅需约2.5月即可获得稳定高表达的高质量细胞株，表达量最高可达13 g/L，稳定性传至PDL 60仍符合行业标准。

4. 总结

三优生物的历经近9年的发展，细胞株构建平台依据600+ SOP，1200+ 国际先进仪器设备，10000+ m²开放实验室，全程C+A级GMP环境，最快仅需约2.5月即可获得稳定高表达的高质量细胞株，表达量最高可达13 g/L，稳定性进行超过60个PDL的评估，旨在打造全球领先的生产细胞产业一体化服务。

▲ 公司外景

▲ C+A级GMP环境

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关于三优生物

三优生物成立于2015年，是一家国际领先的专注于创新生物药研发和服务的高新技术企业；公司致力于实现“让天下没有难做的创新生物药”的使命；公司建立了“差异化CRO、整合型CDO、协同型CPO、特色CRS”于一体的4C综合业务体系。

公司建立了设施设备先进齐全的创新生物药一体化研发实验室；公司发展起了一支以硕士和博士为主的专业团队；公司打造了居于行业领军水平的“超万亿、一体化、智能化”三大创新药研发技术平台；公司建立了以十万亿噬菌体展示分子库为代表的，涵盖原材料制备、分子发现、分子优化、体内外药效、细胞株构建、上下游工艺、临床前研发及产业化开发等的50多个技术子平台。

公司的业务网络已扩展至中美欧等世界各地，公司在波士顿、费城、圣地亚哥和伦敦等地设有业务网点；公司已和全球1000多家制药公司、药物研发机构、诊断试剂产品公司建立了友好的业务合作关系。公司已获得国家高新技术企业、专精特新、ISO9001质量管理体系、GB/T知识产权管理体系等认证。