mRNA原液生产工艺开发的关键考量

mRNA疫苗目前已经成为国内非常火热的赛道，随着mRNA技术的逐渐成熟，除了被应用于预防传染病外，该技术也同样有可能在一定程度上替代和补充蛋白质疗法，为治疗肿瘤、免疫疾病带来了新的解决方案。mRNA疫苗的生产主要包括：DNA模板序列的设计与制备、mRNA原液的制备及纯化、LNP包裹等步骤。其中mRNA原液制备的主要工艺环节包括将线性化质粒DNA转录为mRNA-->化学修饰-->分离纯化-->mRNA原液分装冻存。在这篇推文中，我们将重点讨论mRNA原液生产工艺开发过程中的关键考量因素，包括质粒发酵、碱裂解、质粒纯化、mRNA生产及纯化等。

质粒制备

发酵

随着质粒DNA需求的不断增加，如何优化发酵策略以实现较高的单位体积产量成为研发人员关注的焦点。上游工艺开发的关键参数包括培养基成分、温度、溶氧(DO)、酸碱度(pH)、比生长速率和补料策略等，各个因素对质粒DNA产量的影响简述如下：

培养基成分：用于质粒生产的大肠杆菌高密度发酵培养基，包括碳源、氮源、无机盐和微量元素等。其中碳氮源种类对大肠杆菌的生长和产物积累至关重要，常用的碳源为葡萄糖和甘油，氮源包括有机氮源和无机氮源。此外，碳氮比(C/N)也很重要，C/N过大，菌株生长慢；C/N过小则菌株生长快但不利于产物积累。

温度：大肠杆菌生长的最佳温度是37℃。然而，在分批发酵中能够使用较低的温度(30-37°C)来降低最大比生长速率，以增加质粒复制。对于热敏性的复制起始质粒，通过将温度升高至42℃能够诱导质粒拷贝数的倍增。

DO：大肠杆菌临界溶解氧浓度范围为20%-30%。溶氧不足，大量产乙酸，影响菌体生长，甚至导致菌体自溶；DO过高会产生氧中毒现象。影响DO的因素包括转速、补料、通气量等。

酸碱度(pH)：大肠杆菌最适生长pH为7±0.2，发酵过程通常通过酸碱补料的策略维持发酵液的pH。

补料策略：质粒生产常选择补料分批式发酵，一是利于实现大肠杆菌的高密度发酵，获得更高的产量。其次，大肠杆菌生长速度过快会影响质粒稳定性，调整合适的比生产速率能够控制大肠杆菌生长速率，提升质粒产量。质粒发酵过程通常采用DO-stat策略或者pH-stat策略，调控补料。

表1：不同质粒发酵方法的比较

培养方式

优缺点

摇瓶培养

一些关键工艺参数不可控，如DO、pH和通气等，不便于补料，菌体密度OD600和质粒Titer都很低。

小型的玻璃罐反应器或不锈钢罐反应器

CIP、SIP和验证过程显著增加了批间周转时间，降低了工艺开发效率和生产效率。

一次性生物反应器

具有快速的批次间切换能力，且避免了多质粒、多批次生产的交叉污染。关键工艺参数，如DO、pH、温度、通气流速等都可自动控制和程序化设定。

碱裂解

菌体收集后需要进行破碎处理。当前常用的方法是传统的碱裂解方式，大肠杆菌细胞壁/膜被NaOH和SDS破坏后，细菌体内的蛋白质、RNA、宿主DNA(gDNA)和质粒释放至溶液中并发生变性。当加入酸性中和液后，质粒DNA(pDNA)能够复性，并以溶解的双链超螺旋状态存在，然而变性的蛋白质和宿主DNA聚集并沉淀下来。因此，碱裂解不仅可以释放pDNA，而且为固液分离pDNA与杂质创造了条件，因此，该方法适合大规模生产。

在碱裂解过程中需要把握注意如下一些关键问题：

NaOH应新鲜配置：长时间保存的NaOH与空气中的CO₂反应，导致实际浓度降低，影响裂解效果；

控制裂解反应时间：一般控制在5min内。裂解时间过长会导致pDNA不可逆的损伤，pDNA产物的收率和质量均降低；

使用温和高效的混合方式：剧烈的混合所产生的机械剪切力会导致gDNA断裂进入溶液；反之，混合效率不足会导致局部碱浓度过高，pDNA形成不同构型，或者因局部菌液没有充分裂解，进而为下游纯化带来挑战。

过滤澄清

碱裂解液中和后立即形成白色絮凝，其主要包括细胞碎片、变性蛋白及 gDNA。澄清方法包括：离心；添加絮凝剂((NH₄)SO₄，CaCl₂)；添加NH₄HCO₃或NaHCO₃，自然分层；分级过滤20µm到0.6µm再到0.4µm；及深层过滤等。离心方法不适合放大，由于絮凝部分具有近似溶液的密度，需要高的离心力才能使其沉淀，但产生的机械剪切容易导致gDNA的断裂和释放。因此过滤更为合适，根据不同的工艺选择不同尺寸滤膜的组合进行一级或者多级过滤。

在裂解过程中添加(NH₄)SO₄或者CaCl₂可沉淀去除RNA，产生的沉淀可通过离心或过滤等形式去除，去除沉淀后的料液将用于后续层析工艺。添加NH₄HCO₃能产生大量CO₂与NH₃，添加NaHCO₃能产生大量CO₂，气体能够带动絮凝物上浮至液体表面，形成相对稳定的絮凝层。因而澄清的溶液可以从容器的下端获得。

浓缩换液

当完成前面的步骤后，裂解液体积会变得非常大，在层析纯化前要进行浓缩和洗滤，这不仅能够大大减小样品体积，还能够有效去除RNA、色素和部分HCP、HCD等杂质，减少层析阶段的负荷。通常是采用中空纤维柱或者膜包对其浓缩换液，并控制在一定体积范围内，同时需要将buffer换成适合纯化上样的buffer。膜包的剪切力一般较大，中空纤维的低剪切力特点能够有效保护质粒的超螺旋构象，所以选用中空纤维柱更为合适，根据质粒DNA大小，选择不同尺寸的中空纤维。

表2：根据质粒大小推荐选择中空纤维

质粒的纯化

高质量、高纯度的质粒DNA是细胞和基因治疗过程中的关键成分，质粒的纯度会严重影响到后续IVT生产的产率和纯度，如果质粒不纯，其含有的杂质会严重影响mRNA的质量。

质粒的生产和质量标准

质粒生产一般选择大肠杆菌作为宿主细胞，经发酵培养后裂解细胞得到质粒。初步纯化的质粒料液中一般含有3种构型的质粒（超螺旋、环状和线性DNA），以及HCP、HCD、RNA、内毒素等杂质。因此，为了得到高纯度的质粒DNA需进一步纯化。

高纯度质粒的纯化工艺

当前通常采用色谱层析对pDNA进行纯化，最常用的pDNA捕获方法是阴离子交换层析(AEXC)，另外亲和层析、疏水相互作用层析、分子筛、以及羟基磷灰石(CHT)也常用于pDNA纯化。其各自的优劣势如下表。

表3：质粒纯化方法的优劣势比较

质粒纯化工艺通常采用三步法或两步法。三步法一般为凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析，两步法一般为离子交换层析和疏水相互作用层析。

超螺旋质粒DNA纯化经典三步法：

第1步凝胶过滤层析：凝胶过滤层析是一种利用具有多孔网状结构的颗粒的‌分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的技术。它主要是根据‌物质分子的大小和形状进行分离和纯化。质粒DNA和RNA的分子量相差大，能够首先利用分子筛进行组群分离以快速去除大量RNA（超螺旋质粒纯度约80%，收率>90%），同时置换缓冲液并衔接亲和层析。

第2步亲和层析：将能可逆结合和解离生物分子的配基（也称为配体）与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，再将此亲和吸附剂填充色谱柱。当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基可以有选择地吸附能与其结合的物质，而其他物质从色谱柱中流出。再使用适当的缓冲液进行洗脱，即可获得纯化的目的产物（超螺旋质粒纯度约95%，收率>80%）

第3步离子交换层析：离子交换层析纯化质粒的原理‌是基于离子交换剂与质粒DNA上带电基团之间的相互作用。离子交换剂作为固定相，流动相中的组分离子与交换剂上的离子进行可逆交换来分离物质。在质粒纯化的过程中，这一原理被应用于去除质粒DNA中的杂质。

超螺旋质粒DNA纯化的两步法：

第一步离子交换层析：可去除RNA、HCP、内毒素等，同时捕获pDNA；

第二步疏水作用层析：利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离以去除ocDNA，收获scDNA。

羟基磷灰石：

此外，许多层析介质最初是为纯化蛋白质而设计的，孔径对于纯化pDNA来说相对较小，实际有效吸附面积非常有限。这种限制导致吸附速度和载量都比较低，从而影响了纯化效率。为了解决这个问题，选择使用大孔径的复合填料比如羟基磷灰石(CHT)填料。相比于传统的填料，CHT具有更大的孔径，能够提供更多的有效吸附面积，从而提高吸附效率和载量。CHT能够通过一步法获得药品级纯度的pDNA，对于宿主DNA、RNA以及内毒素都有不错的去除效率，可提高纯化效率，减少操作步骤和时间。

表4. 质粒质量标准如下

mRNA原液生产

在体外转录(IVT)过程中，为了确保IVT产物无多余序列且所获得产物的长度一致，在用于下游IVT之前，质粒模板需要进行线性化处理。质粒线性化是影响下游IVT结果的重要步骤，如果质粒线性化不完全，转录产物可能出现由未完全线性化的模板过度转录导致的后杂峰；反之，如果质粒被过度酶切，转录产物可能出现由被非特异性酶切碎的模板转录导致的前杂峰，因此质粒模板线性化工艺对模板制备来说同样重要。

用于生产mRNA的体外转录(IVT)酶促反应依赖于T7、SP6或T3 RNA聚合酶来催化相应的DNA模板来生产目标mRNA（图1）。该模板必须提前生产，通常是通过纯化质粒的线性化生产或使用PCR扩增靶标区域。除了线性化DNA模板外，IVT组分还必须包括RNA聚合酶、核苷酸三磷酸(NTPs)底物、聚合酶辅助因子氯化镁、含有多胺和抗氧化剂的pH缓冲液等。对于mRNA的加帽，能够在一步IVT反应中通过帽类似物将部分三磷酸鸟苷(GTP)底物取代来完成。或者在二步IVT的第二个酶反应中使用牛痘加帽酶(VCC)和甲基供体作为底物加帽（图1）。虽然这种方法的加帽效率更高（100%，使用帽类似物为60-80%），但使用帽类似物的加帽更快，因为它不需要启动第二个酶反应。

图1：mRNA生产工艺过程

mRNA的纯化

当mRNA由IVT反应生产完成后，需要对反应混合物进行纯化，以达到放行标准纯度（图2）。反应混合物不仅含有所需的产物，还含有一些杂质，包括酶、残留的NTPs和DNA模板，以及在IVT过程中形成的异常mRNA。传统的实验室规模纯化方法是基于DNA酶切去除DNA，然后进行氯化锂沉淀。然而，该方法不能去除异常的mRNA，如dsRNA和截断的RNA片段。去除这些杂质对mRNA的性能至关重要，因为它们会降低翻译效率并改变免疫刺激特性。例如，通过反相HPLC纯化后的修饰mRNA被递送到主要DC细胞后，其翻译出的蛋白产量增加了10-1000倍。

图2：mRNA纯化过程

mRNA纯化工艺一般采用Oligo dT亲和层析进行捕获，去除酶类、NTP及模板DNA等工艺相关杂质。

基于3'poly A尾的分离技术：oligo dT亲和层析，脱氧胸腺嘧啶(dT)的单链序列-Oligo dT，在实验室通常用于捕获mRNA，这个序列与mRNA中存在的poly-A尾巴结合。因此，具有固定化寡聚dT的色谱珠可用于亲和层析的工艺纯化，在IVT过程中产生的单链mRNA的poly-A尾巴会与固定相结合，而杂质则会被清除。这样，IVT未消耗的物质、DNA模板和dsRNA就能够有效地去除。Oligo dT亲和层析能够通过A-T碱基配对特异性捕获全长mRNA的polyA尾，通常需要在高盐条件下上样，盐离子能够屏蔽Oligo dT带负电荷的骨架与mRNA的静电排斥作用，使二者能够相互接近，包含Poly-A尾的RNA通过A-T氢键连接被捕获。降低盐浓度时，Oligo dT的负电荷骨架与poly A产生静电排斥，通过温和中性pH与低电导率洗脱mRNA。有时对样品进行高温(50-70℃)处理能够打开mRNA高级结构，特别是对打开polyA尾形成的二级结构尤为重要。虽然使用亲和层析能够获得高纯度的产品，但也存在一些缺点，如结合能力低和成本效益较低。

中空纤维TFF：切向流过滤，也称错流过滤，进样液流平行于膜表面，部分料液穿过膜（滤液），其余料液（回流液）循环回到进样容器，通过中空纤维TFF能够对实现不同大小的生物分子的高效分离纯化。一般在IVT反应结束后或者色谱纯化完以后使用中空纤维TFF洗脱来实现换液和浓缩的目的。RNA属于超大型生物分子，1.2Kb RNA分子量为400kDa，而属于蛋白分子量上限的IgM才只有960KDa。在IVT反应中，各种不同长度的核酸组分以及RNA聚合酶具有差异性极大的分子量，因此能够通过中空纤维TFF来实现mRNA的初级分离纯化以及色谱柱纯化后的换液浓缩。

总结

mRNA是生物制药领域的一颗新星。人们对这种新型疫苗的兴趣源于这些疫苗与传统方法相比所具有的灵活性、安全性和精确性。癌症和传染病治疗的临床试验数量越来越多，表明市场对这些类型的疫苗的兴趣越来越大。mRNA疫苗精确、安全、灵活、易于大规模生产以及临床级应用。这些疫苗能够在生产方面快速应对疫情爆发。

然而，要达到这个要求，就必须发展可持续和成本可控的生产工艺。尽管mRNA的IVT生产反应比大多数传统的疫苗生产更安全、更快，但它依赖于昂贵和有限的物料。疫苗的下游加工仍然不完善，缺乏可扩展性和成本可控的方法。当前提出了一种微流体生产方法，包括分区化酶促反应，原位产物去除，底物和产物回收，多模式色谱纯化等（图3）。该生产方法具有使原料化合物重复使用和再循环，能够对生产产物进行高通量纯化和质量分析，是可按需生产的可持续、灵活和具有成本效益的疫苗生产工艺。

图3：mRNA疫苗的连续生产过程的概念性设计

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