THUNDER™ TR-FRET 开启药物研发新篇章

时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是一种基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)的技术，作为一种方便灵活的均相检测技术，TR-FRET现今已成为生命科学基础研究和药物研发中最为常用的检测方法之一。

THUNDER^TM TR-FRET由加拿大Bioauxilium公司研发,THUNDER™产品均提供全面验证数据。其产品线聚焦于细胞水平的检测，如细胞信号通路相关的细胞因子，磷酸化蛋白，总蛋白，GPCR相关第二信使cAMP检测等，也涉及适合方法学开发的工具抗体。

图1：THUNDER^TM TR-FRET技术原理图

Bioauxilium简介：一家总部位于加拿大蒙特利尔的专业研发和生产TR-FRET技术试剂公司，其研发人员在TR-FRET技术领域深耕30余年。Bioauxilium 在全球拥有诸多大型药物研发公司和CRO的用户，THUNDER™产品的卓越性能已经广泛得到TR-FRET用户的好评和青睐。优宁维是Bioauxilium在中国区的授权代理商，为中国用户提供顶级性能的THUNDER™产品，高效便捷的技术支持，快速响应的物流和库存，以及灵活可控的价格方案。

利用两种荧光基团能量转移，分别是能量供体Europium Chelate（Donor）和能量受体Far-red dye（Accpeptor）。当供体和受体相互靠近（1-10nm），320/340nm光激发Europium，光子能从供体转移到受体上（615nm），受体发出荧光（665nm）。

图2：FRET技术原理图

利用镧系元素（Eu）的独特性质，其荧光半衰期长达ms级别。延迟50~100μs开始读值后，未结合的受体荧光和背景荧光均已淬灭，即反映样本真实情况。

图3：TRF技术原理图

①操作简单、快速:

均相检测技术：无需洗板和包被，只需两步加样→检测，1-2h快速检测。

②反复读板，信号稳定:

实验体系可支持反复读值，过夜、48h后读值亦可，如：1h，2h，4h，18h...适合预实验摸索实验条件。

③节省样本：

实验体系为20μl，样本仅需15μl。

④高通量，兼容性强：

耗材：兼容94孔，384孔和1536孔微孔板，推荐使用潜孔板以获得最佳窗口；

仪器：现售酶标仪，安装有TR-FRET技术模块均可检测。

⑤严格验证和筛选：

最优的抗体对组合：全部抗体均从5~20对配对抗体中进行筛选后，进行专业严格验证，以确定最终的抗体对。

最大窗口：优化供体、受体浓度得到最佳信噪比（S/B）。

提供最适配的缓冲液和裂解液。

THUNDER检测细胞因子采用经典双抗夹心模型，抗体结合抗原后，用320/340nm光激发供体Eu，产生荧光共振能量转移（FRET）后，进而激发受体产生665nm信号。信号强度与细胞因子浓度成正比。

图4：THUNDER细胞因子检测原理图

取15μl样本或标准品，加入空的微孔板中，再加入5μl的抗体Mix（供体抗体，受体抗体各2.5μl），孵育2h，酶标仪读值。

图5：THUNDER细胞因子检测流程

图6：THUNDER Human IFNγ 细胞因子检测数据展示

*试剂盒提供：100 points，500 points，2500 points，5000 points，10000 points

THUNDER检测胞内磷酸化蛋白采用经典双抗夹心模型，抗体结合抗原后，用320/340nm光激发供体Eu，产生荧光共振能量转移（FRET）后，进而激发受体产生665nm信号。信号强度与胞内蛋白磷酸化水平成正比。

图7：THUNDER磷酸化蛋白检测原理图

第一步：细胞处理，需5分钟或过夜，激动剂/抑制剂处理细胞；第二步：细胞裂解，15~60分钟；第三步：检测，加检测抗体对，孵育1小时或过夜，酶标仪检测。

图8：THUNDER磷酸化/总蛋白检测原理图

图9：THUNDER磷酸化ERK部分检测数据展示

*试剂盒提供：100 points，500 points，2500 points，5000 points，10000 points

THUNDER cAMP试剂盒采用竞争法检测，Eu通过链霉亲和素和生物素结合cAMP，受体FR-anti-cAMP特异性识别cAMP，当药物作用于GPCR膜蛋白后，胞内产生cAMP会与FR-anti-cAMP抗体结合，竞争原有的信号，信号呈现倒S曲线，与cAMP浓度成反比。

图10：THUNDER cAMP检测原理图

首先进行细胞培养处理（给药处理），细胞裂解后依次加入cAMP和检测抗体对，孵育1小时，使用酶标仪进行检测。

图11：THUNDER cAMP验证数据展示

蛋白-蛋白相互作用（PPI）是细胞内多种生物学过程的基础，它们在调控细胞信号传递、基因表达调控以及细胞周期等关键功能中发挥着至关重要的作用。先导药物的筛选及优化是药物研发过程中的关键环节，它在很大程度上依赖于一个有效的模型来确立精确的药理特性。

THUNDER^TM  TR-FRET技术检测PPI时，一种蛋白被标记（直接标记或间接）有供体，另一种蛋白被标记（直接标记或间接）有受体，当两种蛋白相互作用时，供体分子与受体分子的位置接近，供体将产生与蛋白-蛋白相互作用成正比的信号。

PROTAC通过linker将靶蛋白（POI）和E3连接酶拉进，进而靶蛋白被蛋白酶体降解，检测生化水平的结合，也可以建立TR-FRET三元复合物模型。

图12：THUNDER PPI实验模型示意图

 图13：THUNDER 药物筛选模型示意图 

图14：THUNDER PROTAC/分子胶 三元模型示意图

*试剂提供：1000 points，5000 points，10000 points，Buffer提供：2ml，10ml和100ml。