佐剂可以通过不同的方式增加免疫反应的强度和持久性，对于提高疫苗的效果至关重要。研究表明，外源性circRNA在体内与可溶性蛋白一起传递时，可以帮助诱导抗原特异性抗体和T细胞。但由于递送途径的不同可能会有不同的结果，作者进一步通过不同的免疫途径评估了circRNA作为疫苗配方中一种独特佐剂的潜力。

通过三种递送策略（皮下、鼻内和静脉注射）将体外合成的circRNA和鸡卵清蛋白（称为OVAp）免疫给C57BL/6小鼠，并加以阳性对照（AddaVax，皮下佐剂）辅助验证。在第7天和第30天测量了脾脏、引流淋巴结（LNs）和肺部T细胞和抗体反应的大小。结果发现，无论哪种免疫途径，circRNA+OVAp都能诱导强烈的T细胞反应，效果优于阳性对照。免疫后的抗体检测发现，所有给药途径中观察到的血清中抗ovaIgG抗体的水平都相似。

此外，比较circRNA和Poly（I：C）作为鼻内佐剂的免疫效果发现，circRNA和Poly（I：C）诱导的肺部抗原特异性CD8 T细胞的频率相当。总的来说，研究结果表明，circRNA可以作为一种有效的疫苗佐剂应用于多种免疫途径，并且可以与Poly（I：C）和AddaVax的免疫反应相媲美。

在免疫反应的规模、效果和持久性上，先天免疫系统扮演着关键角色。研究者们解析了接种circRNA后强烈的适应性免疫反应背后的生物机制。

首先，他们确定了circRNA在体内传播时的生物学分布。在接种circRNA前后，他们使用Luminex先天免疫细胞因子面板对血清进行了分析。他们将circRNA与荧光团AF488结合，然后皮下注射（s.c.）AF488-circRNA到C57BL/6小鼠。接种24小时后，他们通过流式细胞分析技术分析了引流到腹股沟淋巴结（iLNs）的先天免疫细胞亚群。结果显示，circRNA在单核细胞、树突状细胞和某些巨噬细胞亚群中被检测到。这些巨噬细胞亚群包括边缘脊髓巨噬细胞（MCMs）、边缘窦巨噬细胞（MSMs）和囊膜下窦巨噬细胞（SSM），其中circRNA在MCMs和MSMs中显著富集。

尽管在小鼠的B细胞中没有检测到circRNA，但B细胞的数量明显升高，CD86的上调显示B细胞的激活也增加，同时，单核细胞的数量和活性显著增加，所有的巨噬细胞和树突状细胞亚群的激活也显著增加，而且血清中的炎症免疫因子对circRNA接种的反应也非常强烈。从这些结果可以看出，当circRNA被注射到小鼠体内时，它会诱导多种先天免疫细胞的激活，并引发炎症细胞因子的强烈反应。

树突状细胞（DCs）是最有效的抗原递呈细胞，它们负责处理和递呈抗原、细胞迁移以及T细胞的共刺激。研究者发现，circRNA能够诱导树突状细胞的成熟，进而增强共刺激分子的表达和多种炎症细胞因子以及趋化因子的分泌。

以往研究已证实了circRNA能够激活先天免疫。本研究进一步探讨了其作为佐剂和抗原编码序列时，诱导适应性免疫反应的能力。

研究者使用优化的元件设计和转录了编码鸡卵清蛋白的circRNA（名为circOVA），目的是使circRNA的翻译效果超过mRNA。在体外细胞实验中，他们证明了circOVA具有翻译能力。

研究者使用CAR-T（一种合成的可降解材料）来递送circRNA，这种材料可以在细胞内复杂、保护并高效地递送mRNA和circRNA，从而产生高效的蛋白质翻译。CAR-T-circOVA的转染结果表明，由circRNA编码的蛋白质可以被树突细胞加工并呈现给免疫系统。

在使用CAR-T、circRNA或CAR-T-circRNA免疫小鼠后，他们发现CAR-T传递的circRNA导致了先天免疫亚群的激活谱，这与之前观察到的circRNA的效果相似。这些发现进一步证实了circRNA在激活并诱导适应性免疫反应中的重要作用。