人参皂苷Rg3在小鼠肝癌淋巴结转移模型中诱导细胞凋亡的作用

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将肝癌细胞0.2ml(细胞存活率>95％，浓度为2×10⁶个/ml)注射到小鼠腹腔内。收集腹水细胞，检测细胞存活率和调整细胞浓度(2×10⁶个/ml)后，取0.2ml接种于小鼠的右足垫。

实验分为5个组：Rg3预防组(15只)；Rg3治疗组(13只)；Rg3与顺铂联合组(15只)；顺铂治疗组(14只)；对照组(生理盐水，14只)。Rg3经灌胃给药(0.1ml/只，3mg/kg·d)；顺铂按lmg/kg·d经腹腔注射给药。除Rg3预防组于接种肿瘤前7天开始给药外，其余各组均于接种当日起连续给药24天。于第25天处死小鼠，取原发瘤及右胭窝、腹股沟处的淋巴结组织。

瘤组织常规进行组织固定、切片及染色，并在光镜和电镜下观察细胞坏死和细胞凋亡的形态学变化；将待进行流式细胞学分析的原发瘤和转移瘤组织(每个实验组随机选择5个配对样品)研磨后，过滤，滤液37℃培养1h，乙醇固定24h后，用于流式细胞仪检测。

(1)淋巴结转移抑制率的计算根据光镜下HE切片中转移淋巴结的计数，淋巴结转移抑制率=(同组小鼠数一同组淋巴结转移小鼠数/同组小鼠数)×100％；淋巴结转移程度分为4度：I：转移瘤局限于边缘窦，<总面积的1/3；II：转移瘤>总面积的1/3，<1/2；111：转移瘤>总面积的2/3；IV有被膜外侵犯。

(2)流式细胞仪检测各组凋亡峰比率。

对照组可见大量的瘤细胞，淋巴结窦内有瘤细胞侵入的增多，有些瘤细胞向纤维组织浸润，肿瘤细胞呈多核分裂相；其它4组淋巴结转移均减少，淋巴结的结构多清晰可见（表1，图1）。

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各组中经HE染色后在光镜下选择有明确转移的淋巴结组织块，制备透射电镜超薄切片样品并进行分析。结果显示，Rg3预防组及治疗组在多个视野下可见染色质固缩，并向核周集聚，形成典型的细胞凋亡小体。同时，可观察到部分细胞内有线粒体结构的改变，如线粒体皱缩等；顺铂治疗组的细胞形态改变以细胞破坏为主，染色质向核中间集聚，肿胀的线粒体较多，偶见细胞凋亡小体；Rg3与顺铂联合治疗组的细胞则出现细胞内的染色质既有向中间集聚的，也有向核周集聚的；阴性对照组含有较多细胞核增大的肿瘤细胞，基质弥散，偶见细胞凋亡小体（图2）。

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Rg3预防组、Rg3治疗组、联合治疗组在5份样品中均可见特征性的细胞凋亡峰(5/5)，顺铂治疗组仅有1份样品出现细胞凋亡峰(1/5)，阴性对照组未见细胞凋亡峰(0/5)。Rg3抗肿瘤生长主要作用于细胞G2和S期（图3）。

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本结果显示，Rg3预防组、Rg3治疗组及联合治疗组中，可抑制淋巴结转移，并发生凋亡的肿瘤细胞数目明显增多，说明人参皂苷Rg3具有诱导小鼠肝癌细胞凋亡的作用。在原发瘤及转移瘤中均观察到细胞凋亡的形态学变化并检测到细胞凋亡峰，提示人参皂苷Rg3对肿瘤发生不同阶段的细胞凋亡有促进作用，其抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡具有相关性，这对肿瘤的复发和转移的治疗有积极的意义。

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