NC | 揭示了SWI后大脑皮层共享的炎症神经胶质特征

创伤性脑损伤 (TBI)引起的原发性损伤会导致神经元和神经胶质细胞死亡、轴突损伤、水肿和血脑屏障 (BBB) 破坏。TBI 引起的病理生理过程是通过所有驻留神经胶质细胞类型与来自外周的浸润免疫细胞群的高度协调反应而演变的。为了全面了解脑损伤后的细胞反应，同时进行了单细胞和空间转录组测序分析损伤环境中的多种细胞类型变化。该研究在空间和单细胞分辨率下分析了SWI （stab wound injury）诱导的细胞反应，提供了对多种细胞类型的空间、时间和单细胞反应的洞察，并揭示了涉及 Toll 样受体 1/2 (Tlr1/2) 和趋化因子受体 3 (Cxcr3) 信号通路的常见损伤诱导、共享的神经胶质特征。

为了分析损伤引起的大脑皮层变化，收集了包含皮层 (CTX)、白质 (WM) 和海马 (HPF)区域的大脑切片进行空间转录组测序（图 1a、b）。为了捕捉浸润免疫细胞和神经胶质细胞的反应，在 3 dpi 时进行了空间转录组测序（stRNA-seq）（图 1c）。值得注意的是，确定了一个损伤引起的簇（VI），位于损伤核心周围（图 1b、c）。簇 VI具有特定的转录组特征，如与反应性星形胶质细胞（Gfap、 Lcn2、 Serpina3n、 Vim、 Lgals1、 Fabp7和Tspo）和小胶质细胞（Aif1、Csf1r、Cd68和Tspo）相关的基因中富集，这些基因与中枢神经系统损伤有关（图 1d）。

图1 SWI引起的空间转录组变化

为了评估受伤区域的细胞组成并确定哪些细胞群定义了簇 VI 的转录组谱，对 3 dpi 的SWI皮质和对照皮质的相应区域进行单细胞转录组分析（图 2a）。总鉴定出6322 个单细胞，识别出了神经元和神经胶质细胞簇，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞，以及血管细胞、周细胞和多种类型的免疫细胞（图 2b-d）。有趣的是，观察到几簇免疫细胞和神经胶质细胞仅在SWI大脑中非常丰富，如8_NKT/T 细胞、13_巨噬细胞/单核细胞、17_DC、18_单核细胞和 22_DC 簇（图 2c）。

为了阐明哪些细胞簇对簇 VI 的损伤特异性特征有所贡献，使用 Tangram将单细胞数据映射到空间表达数据集上（图2e、f）。映射预测结果显示包括 11_Microglia、16_Microglia、12_Astrocytes、23_Astrocytes、13_Macrophages/Monocytes、18_Monocytes 和 15_OPCs 在内的几个簇位于损伤核心附近（图 2e）。重要的是，映射到损伤簇 VI 的神经胶质细胞聚集在一起，这意味着某些神经胶质细胞簇对损伤有相似的反应（图 2e）。

图2 空间和单细胞转录组结合可识别在损伤部位导致不同转录反应的细胞群体

由于神经胶质细胞在损伤后表现出时间动态变化，因此在scRNA-seq分析中添加额外的时间点（5 dpi），合并分析了35132个细胞，分布在30个簇中（图 3a-b）。为了阐明每个胶质细胞群如何从稳态转变为反应态，进一步对星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞细进行亚群分析（图 3c-e）。AG5、AG6 和 AG7 簇鉴定为反应性星形胶质细胞的主要细胞群，这些细胞表达高水平的Gfap、 Vim和Lcn2（图 3c）。小胶质细胞簇 MG4 和 MG7 表现出Aif1高表达和稳态标志物Tmem119和P2ry12 低表达（图 3d）。通过对少突胶质细胞进行亚聚类，识别出2个OPC亚群（OPCs1 和 OPCs2）（图 3e）。

对神经胶质细胞进行亚聚类，没有发现任何在 3 dpi 或 5 dpi独有的细胞亚群，表明神经胶质细胞在损伤后逐渐被激活，从而形成具有不同丰度的反应性聚类（图 3f-h）。更具体地说，3 dpi 时的许多星形胶质细胞仍然存在于稳态聚类中，仅部分存在于反应性聚类 AG6 和 AG7 中；而在 5 dpi 时，大多数细胞在AG5 中被检测到（图 3f）。这些结果表明小胶质细胞和 OPC 对损伤反应迅速，其反应峰值范围为 2 至 3 dpi，而星形胶质细胞反应峰值在5 dpi。

图3 SWI损伤会诱发神经胶质亚群发生明显的转录变化

对来自MG4、AG5 和 OPCs2中的 241 个基因进行GO分析，发现其与细胞增殖有关；还确定了与先天免疫和I 型干扰素信号通路相关的许多基因（Ifitm3、Ifit3、Bst2、Isg15、Ifit3b、Irf7、Ifit1、Ifi27l2a、Oasl2和Oas1a）（图 4a-c）。此外，先天免疫相关基因特异性地富集于近端损伤部位，这是神经胶质细胞的一个独特特征（图 4d、e）。随后，利用公共scRNA 数据集进一步探索共享的炎症特征是否是各种脑部疾病中反应性神经胶质细胞的一致特征。分析揭示了在响应 SWI 时，反应性神经胶质细胞中存在共同的炎症特征，这种共同的炎症特征在不同脑部疾病中的星形胶质细胞和小胶质细胞中得到部分保留（图 4f-k）。

图4 SWI损伤会诱发反应性神经胶质亚群的转录变化，从而表征特定的反应状态

基于脑损伤后先天免疫途径的共同调节，研究了干扰 Cxcr3 和 Tlr1/2 途径后损伤引起的转录变化。使用Cxcr3 拮抗剂 NBI 74330和 Tlr1/2 通路抑制剂 CUCPT 22 来干扰上述通路，并对 3 dpi 和 5 dpi 进行 scRNA-seq，分析了分布在 34 个簇中的 55405 个细胞（INT：16964 个细胞，3 dpi_CTRL：3646 个细胞，3 dpi_INH：4615 个细胞，5 dpi_CTRL：14522 个细胞，5 dpi_INH：15658）（图 5a-b）。再次鉴定出不同的细胞簇，值得注意的是，这些簇主要来自 CTRL 和 INH，表明SWI 后抑制 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路不会诱导新的转录状态（图 5c-e）。相反，抑制剂治疗导致反应簇 AG7、MG4 和 OPCs2中共同的炎症基因下调（图 5f ）。总之，这些结果表明Cxcr3 和 Tlr1/2 信号通路在不同神经胶质细胞的初始激活（3 dpi）中调节相似的过程；然而，这种激活随后在5 dpi中发生细胞类型特异性的转录变化。

图5 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路协调反应性神经胶质细胞之间共享的先天免疫反应

小胶质细胞中的炎症基因表达与其激活状态紧密相关，因此评估了 Cxcr3 和 Tlr1/2 抑制引起的炎症基因下调是否会减轻小胶质细胞的反应性。在三种条件（INT、CTRL 和 INH）和时间点（3 和 5 dpi）检查了亚簇小胶质细胞的细胞分布，来自对照的细胞局限于稳态簇，而来自受损样本的细胞在 3 dpi 时主要分布在反应性簇中，在 5 dpi 时可以明显看到向稳态簇的转变（图 6a-b） 。为了进一步阐明在 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制后检测到的小胶质细胞分布变化是否伴有整体细胞形态的变化，使用 Heindl 等人描述的自动形态分析工具评估了小胶质细胞的特征。与CTRL相比，接受INH治疗的动物的小胶质细胞胞体明显较小（图 6e），并且看起来不那么紧凑（图 6d）。总之，Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制加速了损伤后早期小胶质细胞从反应性状态向稳态状态的转变，抑制剂处理的小胶质细胞的明显形态变化进一步支持了这些发现。

图6 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制后的小胶质细胞反应性

为了研究 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制对脑损伤后星形胶质细胞的影响，对星形胶质细胞进行了亚聚类，并研究了所有条件和时间点的细胞分布。源自对照的星形胶质细胞均匀分布在所有稳态簇中；而来自SWI的细胞在 3 dpi 时位于稳态簇和反应性簇中，而在 5 dpi 时大多数细胞分布在反应性簇中（图 7a-b）。来自 CTRL的大多数细胞分布在反应性簇 AG5、AG6 和 AG7 中，而来自 INH的细胞局限于反应性簇 AG5（图 7b）。为了进一步研究抑制剂处理后增殖的潜在改变，评估了星形胶质细胞的增殖。损伤后抑制 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路显着降低了损伤附近增殖（GFAP +和 EdU +）星形胶质细胞的比例（图7d-j ）。尽管 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制足以降低体内星形胶质细胞增殖，但并不能完全使星形胶质细胞恢复稳态。

图7 Cxcr3 和 Tlr1/2 通路抑制后反应性星形胶质细胞增殖减少

该研究结合空间和单细胞转录组来绘制受伤雄性小鼠大脑皮层的转录组特征，并确定导致这种特征的不同神经胶质细胞的特定状态。有趣的是，不同的神经胶质细胞共享大量损伤调节基因，包括先天免疫相关通路 Cxcr3 和 Tlr1/2 下游的炎症程序。发现的神经胶质细胞共享特征的功能相关性凸显了资源的重要性，使其能够全面分析脑损伤后的早期事件。

参考文献

Koupourtidou C, et al. Shared inflammatory glial cell signature after stab wound injury, revealed by spatial, temporal, and cell-type-specific profiling of the murine cerebral cortex. Nat Commun. 2024 Apr 3;15(1):2866. PMID: 38570482.