基因治疗产品(AAV载体) CMC开发关键考量——异质性

AAV载体基因治疗产品是由DNA、蛋白质和相应辅料组成的复杂混合物，其产品自身或产品相关杂质本就存在异质性。

产品异质性是指AAV产品中存在与目标分子在活性、效力和安全性方面性质相当的产品变异体，可能包括翻译后修饰的衣壳、不同的衣壳蛋白化学计量比、包装不完整的病毒。这些产品变异体可能被当作产品变异体，也可能会被列为产品相关杂质，这取决于是否与目标产品分子在活性、效力和安全性方面性质相当，对产品质量是否有负面影响。例如，治疗A型血友病的AAV载体基因治疗产品Roctavian，由于其使用的表达盒超出了AAV5血清型的最大包装能力，在分析患者肝活检样本时发现“有30-40%为全长或ITR融合的表达载体，这表明有相当部分AAV包装是不完整的，例如缺少5’或3’ITR，并且相邻的启动子或polyA区域也可能被截断…”。在这个例子中，这些截断的产品变异体可以被视为产品异质性，这是因为基于成功的临床研究，认为尽管这些截断的产品变异体的比例很高，但该产品的安全性和有效性足以支持市场上市获批。

图片来源:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.02.010

产品相关杂质是指与目标产品分子在活性、效力和安全性方面性质不可比的产品变异体，例如空壳病毒、病毒聚集体、可复制型AAV、未含目的基因的病毒（例如衣壳内包装的是HCD、质粒DNA）、衣壳蛋白不完整等。2020年FDA发布的针对人类基因治疗IND CMC指导原则中提到：“对于病毒载体，典型的产品相关杂质可能包括有缺陷的干扰性病毒颗粒、无感染活性病毒颗粒、空衣壳病毒或复制型病毒。应当对这些杂质进行检测，并且可以以比例形式报告，例如完整病毒与空壳病毒的比例，或物理滴度与感染滴度的比例。” 另外，FDA细胞、组织和基因治疗咨询委员会（CTGTAC）于2021年召开的关于AAV载体基因治疗产品的毒性风险会议中指出：“空衣壳增加了整体抗原负荷，并有可能加剧由衣壳触发的先天和适应性免疫反应。除了刺激先天和适应性免疫反应外，AAV空衣壳可能与完整衣壳竞争目标细胞上的受体结合，这可能需要增加所需的载体剂量。对于早期阶段的CMC开发，应至少检测临床批次中相关杂质的水平，并证明用于临床前研究和临床批次之间的纯度相似。”  国内CDE于2023年发布的《腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则》也有相关表述：“由于 AAV 载体类产品具有较高的异质性，需全面分析各类产品相关杂质，如空壳病毒、不完整包装病毒、游离衣壳蛋白、游离核酸、DNA 错误包装、病毒聚集体、可复制型 AAV 等。”

无论是产品异质性还是产品相关杂质，由于其与目标产品相似的性质，对AAV生产工艺和质量控制提出了巨大的挑战。AAV产品中可能含有包装着不同DNA序列长度的病毒颗粒，这些序列长度可能小于、等于或大于目标AAV产品的DNA序列。

首先，在表达盒的分子设计上，我们需要考虑到野生型AAV的表达盒长度约为4.7kb（包含两端ITRs在内），rAAV的包装机制倾向于优先包装与野生型序列长度相似的序列。虽然略大于4.7kb的基因组仍然可以被包装，但效率要低得多，并且存在包装更多截断体的风险。如果表达盒的长度小于野生型AAV的一半（<2.4 kb），可以采用自身互补型基因组设计（scAAV)，或者可以添加非编码序列作为“填充序列”，以降低包装外源DNA或嵌合体的风险。因此，表达盒的设计应尽可能接近野生型序列长度，以避免影响病毒生产率和产量，以及产品相关杂质的增加。

其次，在正式进行CMC开发前，开展适当的成药性研究工作，即在小规模制备样品基础上进行异质性相关评价。例如空壳率、实心率、错包率、基因组完整性等，以尽早识别风险点。如有必要可进行分子设计优化。

另外，在产品的开发过程中，尤其是早期开发阶段，需对产品进行充分的质量表征研究，充分积累产品异质性以及产品相关杂质方面的数据，加深对病毒衣壳本身以及衣壳内包装物的认知。结合历史生产批次的产品质量监测数据，以及非临床研究与临床试验的产品安全性、有效性相关数据，综合评价产品异质性和产品相关杂质对活性、效力和安全性方面的影响，有助于加速产品成功通过上市审批。

派真生物建立了完善的AAV载体基因治疗产品早期成药性评价平台，配备了例如NGS、MS、AUC、CE等先进的分析仪器，具备全面的质量表征和质量研究能力，已为众多合作伙伴提供了成效性评价服务，助力客户尽早识别风险、高效推进CMC开发。