深度梳理CAR疗法 | 从CAR-T、CAR-NK到CAR-M，都有哪些应用难点与解决策略？

文章来源：BiG生物创新社

嵌合抗原免疫受体（CAR）疗法的发展已有一定岁月，在过去的一二十年间，它已悄然改变恶性肿瘤的治疗版图，也将迎来其广阔的发展前景和未来。今天小编就将对CAR-T，CAR-NK, CAR-M这几种CAR疗法展开讨论，讨论它们各自的优势以及局限性。

近年来，免疫疗法作为继外科切除术，放射性疗法，化疗之后治疗恶性肿瘤的第四大基石持续并且高速发展。现今取得巨大成功的免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂（ICIs）和CAR过继细胞疗法。

相较ICI疗法在多靶点，多适应症的获批上，目前仅有六种CAR-T疗法获得FDA准许用于B细胞来源的血液系统肿瘤，略显力绌。而CAR-T用于治疗实体瘤的大门也尚未完全打开，亟待探索。

何为CAR结构

无论是CAR-T，CAR-NK，CAR-M都有相似的CAR结构，CAR是一种通过基因工程合成的细胞表面受体，由抗原结合区，铰链区，跨膜区和胞内信号转导区组成。

• 抗原结合区可以识别肿瘤相关抗原（TAA），决定了治疗的靶向性。

• 铰链区是一段将抗原结合区暴露给靶标抗原的间隔区域，它的长短通常都是由靶标抗原的位置决定的。

• 跨膜区的主要功能是将CAR定位在免疫细胞膜上。

• 细胞内信号传导区是研究最广泛的领域，是影响CAR免疫细胞抗肿瘤活性的关键。基于对该区域的研究和改进，产生了三代CAR结构。第一代CAR结构仅仅拥有一个CD3ζ信号区域，而T细胞的活化不仅需要TCR-CD3的激活，也需要共刺激信号CD28的激活，所以这限制了第一代CAR-T的抗肿瘤活性和在体内的存续性。二代三代CAR结构则在此基础上，增加了CD28或者4-1BB共刺激结构域，甚至对某些共刺激域进行组合以达到更好的抗肿瘤效果。实验证实，拥有DAP10和CD27两种共刺激域的CAR-T细胞在体内具有最佳抗肿瘤效果。

图1：三代CAR结构（来源：资料一）

近年来发现，除了对信号传导区的设计和改造外，一些修饰也有助于提高抗肿瘤效应，弱化治疗毒性。例如表达趋化因子受体的CAR-T细胞更易浸润至肿瘤微环境（TME）；双靶点T细胞可以靶向两处肿瘤抗原来避免免疫逃逸的发生。

奠基之石：CAR-T

目前通过FDA审批的六种CAR-T药物均靶向B细胞表面marker，其中有四种靶向CD19，用于复发难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL-B）、大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤治疗，而靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的两款药物则是用于多发性骨髓瘤（MM）的治疗。今年3月1日，FDA也正式批准了传奇生物的CAR-T产品，西达基奥仑赛(cilta-cel)，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤患者。这也是首款获得FDA批准的国产CAR-T细胞疗法。NMPA也批准了阿基仑赛注射液和奥基伦赛注射液两款CAR-T药物的上市。除此之外，有超过700项针对不同癌种的CAR-T临床试验正在全界范围内展开。

• 难点一：靶点的选择

几乎所有应用于实体肿瘤CAR-T疗法的靶点在正常细胞上均有表达。尽管在血液肿瘤的治疗上也有此弊端，但因其对被损伤的正常细胞有挽救性纠正办法（免疫球蛋白可以补充靶向B细胞CAR-T治疗后机体功能的损失），以及血细胞本身快速的再生能力，on target-off tumor 效应在血液肿瘤中得以很好的控制。而实体肿瘤却不具备上述优势，CAR-T治疗容易对机体造成毁灭性的打击，且没有很好的解救方案。

策略：

i. Spilt-and策略。可以将初始信号域和共刺激信号域拆分至两种CAR中，使CAR-T细胞只被拥有两种TAA的细胞激活，减少误伤。

ii. And-not策略。使CAR-T细胞在识别到某种正常组织上的marker之时，停止激活。

• 难点二：肿瘤抗原异质性

策略：

i. 选用双或者多特异性CAR，靶向不同抗原。

ii. 制备装配不同类型CAR的T细胞，靶向不同抗原。

• 难点三：CAR-T难以浸润至肿瘤内部或功能受到肿瘤免疫抑制TME的影响

策略：

i. 针对不同肿瘤细胞趋化因子的表达分泌情况，在CAR-T上装备在靶细胞上调趋化因子的受体，提高T细胞浸润能力。

ii. 敲除CAR-T的TGF-β基因，减少免疫抑制水平，提高其抗肿瘤活性。

图2：CAR-T的局限性（来源于资料二）

前进之路：CAR-NK

在CAR-T的研究如火如荼之时，CAR-NK的开发也逐渐成为热点。作为固有免疫系统中的一分子，NK细胞识别靶细胞并不需要MHC的提呈，而是直接与靶细胞结合发挥杀伤功能。不仅如此，因为细胞因子表达谱的差异，NK细胞的活化过程不会引起CRS，这也使得CAR-NK的开发具有其特别的意义和广阔的未来。

• 就免疫细胞的来源来说，CAR-T治疗由于同种异体反应以及移植物抗宿主病（GVHD），往往只能选择自体T细胞。然而大部分接受CAR-T治疗的病人都已经经历过一线或者二线的治疗，很多病人的外周血中T细胞水平很低，自体T细胞的收集时间过长可能会延误治疗时机。而NK细胞的活化并非通过MHC途径，则即使选用异体NK细胞，也可以避免GVDH。NK-92细胞系，脐带血或是诱导多能干细胞等现成的细胞系都能成为免疫细胞的来源，并且可以批量化生产，防止延误治疗时机的惨剧出现。

• 就毒性反应来说，CAR-NK造成CRS和神经毒性的概率非常低，这与CAR-T的CRS高发生率有显著差异。

• 就发挥杀伤作用的途径来说，NK细胞既可以通过CAR途径，也可以通过非CAR途径杀伤肿瘤细胞。例如阻断NK细胞表面的负性调节因子杀手免疫球蛋白样受体（KIRs）提高NK细胞的活性，或是利用ADCC效应杀伤肿瘤细胞。

• 就生命周期来说，NK细胞在体内大约只有两周的寿命。这显然是一把双刃剑，因为虽然它减轻了CAR-NK疗法的on target- off tumor毒性，但如果想要达到持续的缓解状态，就需要反复输注。

图3: NK细胞进行癌症免疫治疗的四种途径

（来源于资料一）

• CAR-T治疗中所遇到的某些挑战在CAR-NK治疗中同样存在，例如靶点的筛选，抗原的异质性，CAR的设计以及NK细胞在肿瘤中的转运和浸润困难等问题。

• 另外值得重视的问题是如何优化CAR-NK细胞的制备和储存工艺，更好地发挥其常备性优势。

• 除此之外，NK细胞较短半衰期所造成的反复输注CAR-NK细胞以维持长期缓解的现状为治疗造成了不小的挑战。

• 肿瘤细胞所表达的MHC分子可与NK细胞表面抑制性KIRs结合抑制NK细胞的抗肿瘤活性。

未来之星：CAR-M

虽然CAR-T在血液系统的恶性肿瘤中取得了巨大的成功，但我们却还没有在实体瘤的治疗上看到明确疗效。CAR-NK虽然可以克服CAR-T疗法的一些缺点，但也仍然在实体瘤的应用上有很大局限性。而因巨噬细胞作为肿瘤微环境中占比最多的免疫细胞，CAR-M相比于CAR-T和CAR-NK具有以下几点优势：

• 免疫细胞在肿瘤微环境中的转运和浸润提高。缺氧环境下，肿瘤组织分泌的许多细胞因子（CCL2，CXCL12，CSF1和VEGF）都可以募集巨噬细胞，而一旦巨噬细胞进入肿瘤微环境，这些细胞因子在巨噬细胞上的受体随即下调，将巨噬细胞牢牢锁在肿瘤TME之中。

• 在免疫抑制微环境中强大的吞噬能力。大部分的实体瘤作为“免疫冷”肿瘤会排斥具有免疫杀伤功能的细胞进入TME，即使少部分进入TME的T细胞也总是呈现出活性缺失的状态。而肿瘤微环境中的M1型（抗炎型）和M2型（抑炎型）都具有强大的吞噬能力，且其表型的高度可塑性也使M1和M2表型的相互转化成为可能。

• 巨噬细胞在发挥吞噬作用的同时，作为抗原提呈细胞，进一步提高CAR-M的抗肿瘤活性。

尽管CAR-M在免疫治疗领域具有巨大的潜能，但目前的CAR-M研究大多处于临床前阶段，只有一项靶向HER2过表达实体瘤的自体CAR-M研究处于Ⅰ期临床阶段，而CAR-M的研究主要集中在通过优化CAR结构活化和提高CAR-M吞噬靶细胞的功能。

图4：CAR-M的研究现状（来源于资料一）

CAR-T疗法在血液肿瘤中取得巨大成就的同时，也因为肿瘤特异性抗原的缺乏，CAR-T细胞难以转运和迁移至肿瘤组织内部以及免疫抑制性TME而难以在实体肿瘤的治疗上发挥作用。

相比于CAR-T , CAR-NK较短的生命周期减弱了 on target-off tumor毒性，不同的细胞因子表达谱降低了CRS和神经毒性发生的风险，NK细胞非MHC途径识别靶细胞的特性使异体CAR-NK发生GVHD的可能性降低。尽管如此，CAR-T所面临的主要挑战在CAR-NK上还是没有得到有效的解决。

巨噬细胞作为TME中主要的免疫细胞，既有强大的吞噬功能，又有抗原提呈的作用以及高度的可塑性，在提高CAR免疫细胞肿瘤浸润以及克服肿瘤免疫抑制TME这两方面有很大发展潜力，这也在Klichinsky实验室进行的一项靶向HER2过表达的实体肿瘤CAR-M试验中得以印证。

CAR免疫细胞疗法已然成为抗肿瘤治疗的重点领域。尽管挑战重重，科学家们仍然拿出了一个又一个的应对策略。在血液学领域高歌猛进的同时，科学家们也正努力让CAR在实体瘤的治疗上占据一席之地。CAR治疗的发展也将侧重于寻找适宜的肿瘤特异性抗原，根据免疫细胞的类型改造CAR结构，减毒策略，鉴别适用于装配CAR结构的免疫细胞，以及控制CAR免疫细胞在体内发挥作用的时间和效力，努力使CAR细胞疗法成为更为有效，安全的抗癌方案。

参考链接：

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3. Pan C, Liu H, Robins E, Song W, Liu D, Li Z, Zheng L. Next-generation immuno-oncology agents: current momentum shifts in cancer immunotherapy. J Hematol Oncol. 2020 Apr 3;13(1):29. doi: 10.1186/s13045-020-00862-w. PMID: 32245497; PMCID: PMC7119170.

4. Sloas C, Gill S, Klichinsky M. Engineered CAR-Macrophages as Adoptive Immunotherapies for Solid Tumors. Front Immunol. 2021 Nov 24;12:783305. doi: 10.3389/fimmu.2021.783305. PMID: 34899748; PMCID: PMC8652144.

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