IF40.8|南京医科大学第二附属医院张业伟教授团队：工程化的细胞外囊泡用于靶向重编程肿瘤相关成纤维细胞

2024年06月24日，南京医科大学第二附属医院张业伟教授课题组在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 40.8）杂志发表Engineered extracellular vesicles for targeted reprogramming of cancer-associated fibroblasts to potentiate therapy of pancreatic cancer。该研究旨在通过利用工程化的细胞外囊泡靶向调控胰腺癌中的肿瘤相关成纤维细胞，探索提高治疗效果的新策略。

胰腺癌是一种高度侵袭性和致命性的恶性肿瘤，居于癌症相关死亡原因的第三位。肿瘤生长和治疗抵抗受到肿瘤微环境（TME）中癌相关成纤维细胞（CAFs）复杂关系的影响，CAFs在胰腺癌的发生发展中起着关键作用，包括调控肿瘤生长、免疫逃逸、治疗抵抗以及细胞外基质（ECM）重塑。因此，针对CAFs的调控成为提高胰腺癌治疗效果的潜在策略。近年来，细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯和潜在治疗应用方面引起了广泛关注。EVs是细胞释放的带膜囊泡，能够将生物活性分子传递给受体细胞，并且可以被改造以提高其货物传递效率和靶向性。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，并表现出抗肿瘤和抗纤维化特性。BMSCs分泌的EVs（BMSC-EVs）结合了EVs和BMSCs的优势，成为选择性靶向CAFs治疗胰腺癌的一种有前景的方法。

本研究旨在探索并验证利用工程化细胞外囊泡（EVs）靶向调控胰腺癌中的癌相关成纤维细胞（CAFs），以提高治疗效果的可行性和有效性。首先，研究miR-138-5p在胰腺癌CAFs中的表达及其对CAFs功能和纤维化表型的影响，探讨其潜在的调控机制。其次，通过超声波技术将抗纤维化药物吡非尼酮（PFD）和miR-138-5p装载到骨髓间充质干细胞（BMSCs）分泌的EVs中，并利用整合素α5靶向肽进行表面修饰，制备整合素α5靶向的EVs（IEVs）。在此基础上，通过2D细胞功能实验、条件培养基共培养实验、三维多细胞肿瘤球实验及皮下移植瘤模型，评估IEVs-PFD/138对胰腺癌CAFs的重编程效果及其对肿瘤生长的抑制作用。最后，通过患者来源的移植瘤（PDX）和正位胰腺癌小鼠模型，验证IEVs-PFD/138与吉西他滨联合治疗在胰腺癌治疗中的潜在应用价值。通过本研究，旨在提供一种新颖且高效的胰腺癌治疗策略，揭示靶向CAFs的潜在机制，并为未来的临床应用奠定基础。

为了得到工程化永IEVs-PFD/138，首先用hTERT慢病毒感染原代BMSCs得到永生化的BMSCs，通过超速离心法获得其EVs，再通过超声法将PFD和miR-138-5p mimic装载入EV中，然后采用共孵育法，将DSPE-PEG-CRYYRITY（ITGA5靶向肽）插入到EVs膜中。TEM可见其EVs呈现双层膜囊结构；WB结果显示EVs的阳性标志物CD9、CD63、Alix以及Tsg101；NTA显示EVs粒径为：148.6±12.9nm，表面修饰ITGA5结合肽后，IEVs粒径为：163.2±27nm；QRT-PCR显示EVs与miR-138-5p超声后，其miR-138-5p含量显著提高。紫外分光光度计显示吡非尼酮（PFD）负载率约为：28.61%±1.2%。荧光共聚焦、流式细胞检测、QRT-PCR显示IEVs有更好体外CAFs靶向能力。IVIS结果显示IEVs有更好的体内CAFs靶向能力。

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功能实验显示IEVs-PFD/138可以抑制CAFs的增殖和迁移能力，根据生物信息学寻找miR-138-5p的靶基因，通过双荧光素酶报告基因实验、单细胞数据分析、组织蛋白芯片数据分析、功能试验等证实了FERMT2是miR-138-5p的靶基因，并验证了其功能。

图2

通过IP、WB实验证实了IEVs-PFD/138的体外功能的机制，同时ELISA显示了IEVs-PFD/138对CAFs分泌的CXCL12、TGF-β1、IL-6及脯氨酸含量的影响；共培养结果显示IEVs-PFD/138可以逆转CAFs的促癌作用；3D多细胞肿瘤球实验显示IEVs-PFD/138可以增加药物在肿瘤内的渗透能力，因此增加吉西他滨的治疗效果。

图3

在皮下富基质小鼠胰腺癌模型中，IEVs-PFD/138显示出很好的抑癌和逆转纤维化微环境的功能，同时具有良好的生物相容性。

图4

在重度免疫缺陷鼠皮下PDX模型中，IEVs-PFD/138联合吉西他滨显示出很好的抑癌效果，同时IEVs-PFD/138降低了肿瘤间质压力，增加了瘤内吉西他滨的浓度，改善了纤维化微环境，改善了乏氧，提高了对吉西他滨的敏感性。

图5

在裸鼠原位富基质胰腺癌小鼠模型中，IEVs-PFD/138联合吉西他滨显示出很好的抑癌效果，IEVs-PFD/138联合吉西他滨减少了肿瘤腹腔转移、肝转移、腹水的发生。

图6

研究中所使用的的人端粒酶逆转录酶（hTERT）慢病毒由上海吉凯基因提供，通过此病毒构建了永生化人胰腺癌肿瘤相关成纤维细胞和永生化人骨髓间充质干细胞。

南京医科大学第二附属医院张业伟教授为本文的通讯作者，博士研究生周鹏成为本文的第一作者。