BCR测序与质谱技术：双重视角解读适应性免疫

作者共使用了三个数据集。数据集1包含1例健康人的bulkBCR-seq、scBCR-seq和Ab-seq数据，采用液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）进行肽分析。数据集2包含10例健康成人的bulkBCR-seq、scBCR-seq数据。数据集3是来自6名儿科患者的公开BCR-seq数据，分选了不同的B细胞亚群进行的bulk和scBCR-seq。

图1

作者进行了同一个体和不同个体每种测序方法的结果比较，发现尽管方法之间存在差异，但bulkBCR-seq和scBCR-seq都足以表征个体独特的VH基因使用概况，与技术方法、细胞亚群这些因素相比，个体是VH基因使用的最大决定因素，也就是说同一个体的V基因使用情况相似程度最高。

通过不同测序方法的共享CDR3序列分析比较，发现bulkBCR-seq提供的更高采样深度可以更好地覆盖BCR库多样性，特别是在本身高度多样化的B细胞亚群中，例如幼稚B细胞。对于scBCR-seq，合并技术重复有助于弥补BCR库的低覆盖率和与bulkBCR-seq的低克隆序列重叠比例。

接下来作者研究了Ab-seq是否可用于鉴定血清抗体中的特定克隆型，并有可能从短肽中回收完整的V（D）J序列。当Ab-seq肽唯一地映射到该克隆型BCR-seq 参考序列并与其CDR3序列连续重叠至少3aa时，即可识别出克隆型。有887（4.8%）个肽满足该条件，与scBCR-seq相比，bulkBCR-seq贡献了大部分肽匹配。按抗体酶对CDR3重叠肽进行分组，胰蛋白酶提供的重叠肽最多，其次是AspN。在887个CDR3重叠的肽中，34.8%的肽定位于唯一的参照克隆型，65.2%定位于多个参照克隆型。研究BCR参考克隆型的排序分布，即克隆丰度，作者发现几乎所有独特定位的CDR3重叠肽与扩增较少的克隆型对齐，bulkBCR-seq与scBCR-seq均观察到类似的趋势。（图2）

图2

通过将Ab-seq肽映射到BCR-seq参考克隆型，从唯一定位的 CDR3 重叠肽中，可以检索到来自参考克隆型的序列信息，包括 VJ基因名称、CDR3序列以及该克隆型的完整V（D）J序列。无论是bulkBCR-seq还是scBCR-seq，均能获得Ab-seq肽映射的单链的V（D）J序列，scBCR-seq还可以鉴定相同B细胞的配对链的V（D）J序列。（图3）

图3

总之，虽然在Ab-seq中只有一小部分质谱肽段可用于克隆型鉴定，而且大多数Ab-seq肽段都映射到了BCR基因库中扩展较少的克隆型，但利用BCR-seq参考库扩展的Ab-seq技术直接从血清抗原抗体中恢复V(D)J序列是可行的。特别是利用scBCR-seq 参考库，配对链V(D)J序列重建也具有相当的可信度。

小结

首先采用生物信息学方法预测病毒刺突蛋白的受体结合域（RBD）的B细胞抗原表位及其邻近区域，选取4个候选表位合成并制备亲和层析柱。使用这些亲和层析柱从恢复期COVID-19患者的血清中纯化与不同表位结合的IgG。然后，用蛋白质质谱分析其可变区序列的肽信息。另外分选患者外周血B细胞进行BCR测序，将质谱得到的序列和BCR库的序列进行定位，得到IgG可变区的整个基因序列。进而鉴定IgG CDR3的中和活性。（图1）

图1

从15例恢复期患者中获得27131条IG重链和轻链V（D）J序列，其中365条序列仅存在于9例有中和抗体的恢复期患者中。随后，将与E1、E2、E3和S1蛋白结合的中和抗体的可变区的肽序列与同一个体的BCR V（D）J序列进行图谱分析，发现15个恢复期患者中有10个显示肽序列与基因序列之间的一一匹配。此外，有55个序列在具有中和抗体的患者中由多个个体共享，但在没有中和抗体的患者和健康人中不存在（图2）。这些数据表明作者获得了中和抗体的整个序列。然后作者通过模型验证了这种方法分选的CDR3肽可以在体外成功阻断SARS-CoV-2感染。

图2

小结

作者开发了一种新的研究方案，将质谱与免疫组库基因测序相结合，可以快速获得抗体的整个可变区域序列，可用于构建SARS-CoV-2特异性抗体库。该新方案也适用于快速筛选其他病原微生物的中和抗体。

N-连接的糖基化位点仅出现在具有基序（N-X-S/T，其中X=非脯氨酸）的氨基酸序列位置处。分别对MuSK MG患者、AChR MG患者和健康对照受试者进行PBMC BCR测序，筛选IgG亚型序列。与健康对照组（10.3%）相比，AChR MG（13.0%）和MuSK MG（17.4%）的中位IgG-V^N-Glyc位点频率显著升高（图1A）。

为了研究这种频率升高是通过优先使用编码N-X-S/T基序的三个 VH基因片段（IGHV4-34、IGHV1-8 和 IGHV5-10-1）还是通过SHM产生的，作者评估了VH基因片段germline reversion中该基序的频率（图1B)，与健康对照相比，AChR MG患者的IgG-V位点种系频率无差异，而MuSK MG组显著升高。说明AChR MG患者IgG-V^N-Glyc位点频率升高是来自SHM，而MuSK MG患者的频率升高是SHM和特定V基因使用频率增加的共同作用。

图1

然后作者通过蛋白质组学研究发现一部分MG患者在Fab区域具有非典型IgG糖基化，可能是由于IgG-V^N-Glyc，这在很长一段时间（3-4 年）内似乎是一个稳定的特征。

接下来作者通过质谱分析验证了三种患者来源的单克隆抗MuSK 抗体（MUSK1A、MUSK1B、MUSK3-28）和一种患者来源的单克隆抗AChR抗体（单克隆抗体637）中的N-糖可变区占有情况（图2）。发现所有三种MuSK自身抗体都是糖基化的，并且突变的变体的异质性显著降低，质量轻约2kDa（图2A-C）。由于N-聚糖是极不均一的分子部分，含有IgG-V^N-Glyc的蛋白质具有升高的质谱异质性。这些发现证实了糖基化的存在，AChR抗体也得到类似的结果（图2D）。总之，MG 中的自身抗原特异性抗体（mAbs）在其IgG可变区可能含有被占据的N-糖基化。

图2

最后作者测试了IgG-V^N-Glyc对MG mAb结合的影响，发现IgG-V^N-Glyc的丢失不影响三种抗MuSK mAb或抗AChR mAb与其各自靶标的结合。