儿童肾小球疾病预后指标新发现，T细胞骨架方案推动临床科研进步

immunology 肾小球疾病 T细胞骨架方案

09/10

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面对临床样品中复杂的免疫细胞类群信息，深入剖析全貌不知从何入手？本篇碧迪医疗高分文章带领大家一起探索在临床疾病研究中，使用流式细胞术全面表征临床样品中的免疫细胞亚群。话不多说，让我们一起欣赏发表在《Frontiers in Immunology》的一篇关于流式细胞术在临床疾病研究中应用的新文章。

热点话题

全球范围内特发性肾病综合症发病率和复发概率^[1]

特发性肾病综合征（Idiopathic Nephrotic Syndrome, INS）是儿童最常见的肾小球疾病，其特征是肾小球滤过屏障受损，导致尿液中蛋白质丢失、低白蛋白血症和水肿。

目前，临床上对所有患者的初始治疗都是标准化的。首次发病时，患者会接受口服泼尼松治疗，大多数儿童在4周内就会出现反应，被定义为类固醇敏感型（Steroid-Sensitive Nephrotic Syndrome, SSNS）。但在接受标准泼尼松治疗后，SSNS类型患者经常出现高度异质性，部分患者疾病复发。从疾病首次发作开始就能预测疾病进程严重程度和复发风险的预后标志物，到目前为止尚未发现。

谈及INS的发病机制，近50年来，INS被认为是系统性T细胞失调伴随的肾脏表现。另一方面，抗CD20的B细胞耗竭单克隆抗体（主要是利妥昔单抗）取得了一定的治疗效果，暗示B细胞参与了该疾病的发病机制。

本篇文章报道了一套多色流式分析方案用于INS患者B和T淋巴细胞免疫全面表征，为疾病进展和治疗后效果预测提供了稳定可靠的方法。

亮点内容

儿童肾病综合征的病理生理学机制（免疫系统和基因层面）^[2]

此文献使用了多色细胞分析解决方案，亮点多多，一起来看看吧：

首次对特发性肾病患者外周血免疫细胞进行深度全面解析

利用多色流式细胞术深度分析了B细胞和T细胞共13个淋巴细胞亚群

首次利用T细胞骨架方案研究并提出了疾病初始B细胞亚群水平与疾病复发风险的关系

科学发现

4月2号，来自意大利罗马Bambino Gesù儿童医院科学研究和医疗保健研究所（IRCCS）肾病学实验室的研究小组在Frontiers in Immunology上发表了一篇文章，他们构建了一个可重复且标准化的多色流式分析方案，以全面描述特发性肾病综合症患者淋巴细胞，在治疗前后的特点和改变。采用该方案，作者使用BD LSRFortessa流式细胞仪和BD Sirigen+Real系列染料成功在患者外周血中鉴定到了多个B细胞与T细胞亚群，并分析了特定细胞亚群水平与复发风险的相关性。

外周血免疫细胞流式门控策略

首先

作者采集了患者发病时（口服泼尼松进行治疗前）和3个月后的外周血单个核细胞（PBMC），长期保存于液氮中。解冻后的细胞样品被均分在两个试管中，分别用针对不同表面标记物的单克隆抗体进行染色，随后对细胞样品进行流式分析。通过FSC/SSC去除细胞碎片、过小的单核细胞和过大的黏连细胞团后，作者对CD45⁺淋巴细胞进行了亚群鉴定和特征解析。根据品系标记物将CD45⁺细胞分成CD19⁺B细胞、CD3⁺T细胞和CD56⁺NK细胞，后文重点研究B细胞与T细胞亚群。

在CD19⁺B细胞中，作者根据表面标记物的表达识别到了以下亚群：CD38^highCD24^high的过渡型B细胞（transitional）、CD38^highCD24^-的浆母细胞/浆细胞（plasmablasts/plasma）、CD21⁺CD27^-的成熟初始B细胞（mature-naïve）、CD21^-CD27^-的非典型记忆B细胞（atypical memory），以及CD27⁺记忆B细胞（memory）。在后者中又根据免疫球蛋白的表达分为IgM^-IgD^-经类别转换B细胞（switched B cells）、IgM⁺IgD⁺未切换记忆B细胞（unswitched B cells，也称为IgM记忆B细胞）、IgM⁺IgD^-IgG^-记忆B细胞和IgM^-IgD^-IgG⁺的IgG⁺切换记忆B细胞。

另一方面，作者初步将CD3⁺T细胞分为CD4⁺和CD8⁺两个亚群；以指征细胞分化阶段与迁移能力的标记物可以将CD3⁺T细胞分成CD45RA⁺CCR7⁺初始T细胞、CD45RA^-记忆T细胞、CD45RA⁺CCR7^-终末效应记忆T细胞（TEMRA），以及CD38^highHLA^-DR⁺高度活化T细胞。同样的，作者在CD4⁺T细胞中又鉴定到了CD25^highCD127^-调节性T细胞（Treg）和CXCR5⁺HLA^-DR^-滤泡辅助性T细胞（Tfh）。

特发性肾病综合征患者与年龄匹配对照贡献者淋巴细胞的全面特征描述

接着

作者们对第一步流式分析结果进行t-SNE降维处理，分别展示了特发性肾病综合征患者与年龄匹配对照贡献者的B细胞（上图A小图）和T细胞（上图B小图）十三个亚群的分布特点，以及不同表面标记物的表达情况。

其中，大多数B细胞亚群占比（包括过渡型、成熟初始型、浆母细胞/浆细胞、记忆B细胞、未切换型、切换型和异常记忆型B细胞）在INS患者发病时显著高于对照。相对于对照组，INS患者发病时CD4⁺T细胞、调节性T细胞（Tregs）和终末分化T细胞（TEMRA）水平显著减少。

未复发和复发激素敏感性肾病综合征患者的B细胞亚群特征

进一步，作者研究并确定了疾病初始时淋巴细胞的水平与疾病治疗后复发的关系。根据12个月的随访结果，作者将激素敏感性肾病综合征（SSNS）患者分为复发者和非复发者，并比较了两者过渡型B细胞、成熟幼稚型B细胞、浆母细胞/浆细胞、非典型记忆B细胞、总记忆B细胞、未切换记忆B细胞、切换记忆B细胞和IgG⁺切换记忆B细胞的水平。

作者发现，相比于非复发患者，复发患者在发病时具有显著较高水平的过渡型B细胞、记忆B细胞、未切换记忆B细胞亚群。在接受泼尼松治疗3个月后，复发者和非复发者之间并未发现显著差异。

疾病初期未切换记忆B细胞水平可预测儿童特发性肾病综合征（INS）的复发

最后

作者进一步比较了上述三种B细胞亚群与复发风险之间的关系。通过ROC曲线分析，他们发现疾病初始时未切换记忆B细胞水平是预测复发的有效指标，最佳预判截断值为1.5%。未切换记忆B细胞水平越高，病人复发的可能性也越高。

实验方法

本篇文献使用了BD LSRFortessa流式细胞仪和BD系列流式科研试剂，本次实验设计的实验方案，对人PBMC染色后鉴定了多个B和T细胞亚群，并深入分析了细胞亚群与疾病进程的关系。实验产生的数据用BD FlowJo^®对数据进行降维处理。细胞表面标记物如下表格所示：

该方案使用了碧迪医疗以下试剂进行方案优化：

Sirigen系列染料（BUV和BV）：

Real系列染料（RB和RY）：

在对T细胞进行类群鉴定与特征分析中，作者使用了碧迪公司“人类T细胞核心标记物检测试剂盒（Human T cell Backbone Panel Kit，568263）”。其中包含（共5种标记物）：

CD3：

T细胞主要标记物

CD4与CD8：

区分辅助性和细胞毒性T细胞的标记物

CD45RA和CCR7（CD197）：

指征T细胞分化状态和迁移能力的标记物

此试剂盒能够满足绝大多数对T细胞亚群、分化状态鉴定和表征的研究。

另一方面，试剂盒中的5种标记物所对应通道的发射与接收光谱具有较少的重叠，相互之间的影响较少，适用于市面上绝大多数流式分析与分选仪器。在此基础上还可以增加至少5种常用的通道，添加额外的标记物即可实现对T细胞类群更加细致的研究。此外，该试剂盒的使用与细胞内标记染色是完全兼容的，更大程度上拓展了实验研究的覆盖面。

相比于市面上其他品牌的T细胞标记物鉴定试剂盒，这款试剂盒同时包含CD45RA和CCR7，在鉴定CD4⁺或CD8⁺T细胞基础上，可直接对初始T细胞、记忆T细胞进行鉴定。在本篇文章中，作者就使用该试剂盒鉴定到CD45RA⁺CCR7^-终末分化细胞（TEMRA）在孩童INS发病初期数量水平有明显升高。

总的来说，该试剂盒覆盖了多个T细胞核心标记物，可以直接用于鉴定T细胞亚群，对于具备复杂免疫环境的样品，很大程度上简化了实验设计和步骤，仅需要添加少许额外的标记物就能够解析T细胞大部分亚群。

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碧迪点评

综合全文，本文建立了一个新颖、可重复、针对特发性肾病（INS）的流式多色分析方案，首次对患者循环淋巴细胞进行全面表征。基于此方案的数据结果，相比于T细胞亚群，INS患者的B细胞亚群发生了更大程度上的改变，丰富了先前对INS发病机制的认知。

与此同时，他们还发现了多个B细胞亚群水平与复发风险高度相关，根据疾病初始阶段患者外周血中IgM⁺IgD⁺未切换记忆B细胞水平能够较为准确预测疾病复发的风险。

这些结果可能有助于根据B细胞表达谱制定不同的治疗策略，为识别新的、更个性化的治疗靶点提供线索。

参考文献

1. Veltkamp F, Rensma LR, et al. Incidence and Relapse of Idiopathic Nephrotic Syndrome: Meta-analysis. Pediatrics, 2021 Jul;148(1):e2020029249.

2. Vivarelli M, Gibson K, et al. Childhood nephrotic syndrome. Lancet. 2023 Sep 2;402(10404):809-824.

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