Digital Western技术助力IRAKs PROTAC药物研发

2022年12月14日，美国Kymera Therapeutics公司宣布其IRAK4（白细胞介素-1受体相关激酶4）PROTAC药物KT-474 在Ⅰ期临床试验取得积极临床结果。Kymera合作伙伴赛诺菲承诺将KT-474推进到Ⅱ期临床实验。KT-474将成为又一迈进Ⅱ期临床的PROTAC药物。

Digital Western技术已全面助力白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)蛋白研究。IRAKs蛋白家族由IRAK1、IRAK2、IRAK3（IRAK-M）和IRAK4四种同工酶组成，介导白细胞介素1受体（IL-1R）和Toll样受体（TLR）信号通路。活化的TLR/IL1R导致Myddosome组装，这是一种由MyD88、IRAK4和IRAK2组成的多蛋白复合物，它通过IRAK4依赖性磷酸化激活丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK1。IRAK1与E3泛素连接酶TRAF6结合，后者介导IKK复合物的激活，导致NF-κB靶基因的转录。IRAK1/TRAF6 复合物还可以通过组装具有催化活性的TAB2-TAB3-TAB1复合物来激活JNK和p38信号传导。在单核细胞和巨噬细胞中，IRAK3通过抑制IRAK4和IRAK1的激活负向调节IRAK信号传导。

IRAK1和IRAK4是组织中广泛表达的经典激酶，而IRAK3是一种假激酶，只在骨髓细胞系中表达，缺乏激酶活性。迄今为止，没有传统小分子抑制剂靶向IRAK3，2020年，Degorce等报道了第一个选择性降解IRAK3靶点的PROTAC分子，但相关研究没有揭示降解后功能变化。IRAK3作为TLR通路的负调控因子，可能会降低先天免疫反应。在肿瘤微环境中，敲除IRAK3显示骨髓细胞功能增强以促进抗肿瘤响应。与肿瘤细胞共培养的单核细胞显示TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表达降低，但IRAK3表达增加。相反，与野生型 (WT) 树突状细胞（DCs）相比，IRAK3-/-小鼠树突状细胞的促炎细胞因子表达增加，从而诱导T细胞反应并导致肿瘤生长抑制，降解IRAK3可能成为免疫肿瘤治疗中一个有吸引力新策略。IL-12是由活化的树突状细胞和巨噬细胞产出的主要促炎细胞因子，通过诱导促IFN-γ细胞因子，在促进Th1介导的抗肿瘤反应、T细胞活化和增殖中发挥重要作用。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC选择性降解IRAK3来研究后续DCs中功能和表型变化。根据下图在人单核细胞衍生的树突状细胞中基因编辑敲除IRAK3基因，采用基于毛细管电泳技术Digital Western（也称为Simple Western）验证基因敲除效率，2个供体显示完全敲除，另一个显示保留10% IRAK3蛋白表达，结果显示通过CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表达水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通过检测细胞上清液中细胞因子分泌水平，结果显示IL-12p40分泌显著增加，与对照相比，浓度增加了1.5到2倍。同时IL-12p70分泌也具有增长趋势，但IL-10没有影响。

通过系列体外实验，筛选到一个选择性降解IRAK3的PROTAC苗头化合物，D-1。无论有无LPS刺激时，采用D-1处理原代人DCs都可实现浓度依赖性IRAK3选择性降解，24h实现最大降解活性。进一步检测分泌细胞因子浓度水平变化，在100 ng/mL LPS刺激时，IL-12p40细胞因子浓度随着降解剂浓度依赖性增加。

采用PROTAC D-1和LPS处理的DCs中IL-12p40浓度增加与CRISPR/Cas9 KO实验结果一致的，证明了两种方法有效性，证明通过PROTAC蛋白降解剂对IRAK3靶点可成药性。通过深入了解研究IRAK3生物学，扩大了PROTAC分子降解靶点库，并支持了潜在治疗靶点的基因编辑缺失和化学降解之间的相关性。

AbbVie公司的该项研究主要利用全自动毛细管Digital Western技术检测IRAK3靶蛋白表达水平，探究CRISPR/Cas9基因编辑技术和PROTAC蛋白降解技术处理后细胞蛋白表达，准确定量靶向蛋白降解研究过程量效关系。再次证明了Digital Western可快速地、可重复性精准定量内源性蛋白质表达，是PROTAC技术平台构建的必备技术。

检测微量珍贵动物组织样本如脑组织或肌肉组织等，实现靶蛋白和细胞信号通路蛋白质标志物定量检测。将在体内PD/PK和药理学实验中发挥重要作用，加快药物研发。

自动化标准化：Digital Western快速获得高质量重复性数据，数据合规，软件符合FDA 21 CFR Part 11要求，可满足临床实验技术要求。已被用于小分子药物临床实验和基因治疗临床试验中蛋白质标志物检测。

技术适用于药物研发临床前和临床不同阶段检测需求，开发一种方法满足不同场景下生物分析需求，从药物发现阶段In vitro细胞水平系实验、到动物体内PK/PD实验、Ex Vivo实验，一直到药物临床试验中病人活检组织样本。

参考文献：

1. Rhyasen, G., Starczynowski, D. IRAK signalling in cancer. Br J Cancer 112, 232–237 (2015).

2. Ann Rowley, Brian S Brown, etc. Targeting IRAK3 for Degradation to Enhance IL-12 Pro-inflammatory Cytokine Production.ACS Chem Biol. 2022 May 17

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