如何提高细胞外囊泡产量？

引言

近年来，细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体，已在多种疾病的治疗方面展现出较大的潜力。其中，间充质干细胞外泌体的临床应用更是取得了较为显著的进展，如：急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、慢性肾脏疾病、移植物抗宿病（GvHD）、骨关节炎、中风、阿尔兹海默症、Ⅰ型糖尿病、粉刺痤疮及皮肤色素沉着等疾病领域的治疗。尽管基于外泌体治疗具有巨大潜力，但传统生产方式产量低和放大困难等特点，严重制约了外泌体的临床应用转化。

来自上海第二军医大学的苏长青教授在Theranotics上发表1篇综述，总结了提高外泌体产量的方法，包括物理和化学刺激、增加钙离子内流、细胞骨架固定、药物刺激以及特定基因的过表达等，可有效提高外泌体表达量。

以色列理工学院的科学家们在《Biotechnology Advances》发表综述，总结了物理、化学、生物等提高外泌体分泌和产量的多种策略，其中机械压力等策略可将外泌体产量提升100-150倍。

下面我们就一起看看具体有哪些方法可以提高细胞外囊泡产量吧！

有研究表明，采用3D培养方式替代传统2D培养可将外泌体产量提高5-10倍数。已知缺氧是一种环境应激因子，可刺激细胞分泌外泌体，中度缺氧可增加外泌体产量2-3倍。

此外，适度降低pH值可显著提高外泌体的表达量（69倍）。有证据表明，葡萄糖不足或过量均可以刺激外泌体的表达。在葡萄糖缺乏的条件下，永生化H9C2心肌细胞表现出外泌体分泌量增加了约4倍。

采用物理刺激的方法可显著增加外泌体的产量。常用物理刺激包括：剪切力、周期性张力、声音和电场刺激等。机械感知是细胞间和细胞与微环境之间通讯的基本途径。它包括细胞对机械负荷的反应，这可能导致EVs分泌以进行近端和远端细胞间的通讯（Paolicelli et al., 2019; Turturici et al., 2014）。因此，机械刺激可能干扰细胞外泌体分泌机制，并在某些条件下增强外泌体的分泌。

例如Patel等报道采用低剪切力（shear rate 1.5×10-2dyn/cm2）刺激人真皮血管内皮细胞，相比静态流体对照可增加外泌体水平100倍。24小时周期性张力刺激也可增加牙周韧带细胞外泌体分泌水平30倍。

另一项研究揭示了将中等剪切应力水平（在0.5到5 dyn/cm2范围内）应用于由DPSC构建的3D工程组织会导致EVs产量增加超过150倍（Guo et al., 2021）。另一种使用声波刺激EVs生产的物理方法被报道（Ambattu et al., 2020）。通过使用高频超声波（US）照射（4 W，10 MHz），EVs产量增加了8-10倍。将0.34 mA/cm2电场应用于小鼠黑色素瘤和小鼠成纤维细胞细胞60分钟导致EVs分泌速率显著增加（1.7倍），同时保持细胞存活率和颗粒分布。

一般来说，细胞处于应激状态下会增加外泌体的分泌。Jackson等人使用IAA和DNP阻断细胞能量生产途径导致细胞应激，从而有效地增强外泌体生产（Ludwig et al., 2020）。IAA/DNP结合同时抑制糖酵解和氧化磷酸化导致细胞能量耗竭（ATP水平降低，AMP水平升高），刺激细胞释放腺苷，这激活了A2B受体系统，最终导致外泌体产量增加3到16倍。

使用RNA干扰技术调低两种内吞体转运相关蛋白的表达，可使外泌体表达量增加两倍。此外，脂联素（adiponectin，APN）和小分子药物（如非诺特罗、去甲基肾上腺素、N-甲基多巴胺、美芬新、毛喉素）调控ESCRT-非依赖合成途径相关基因等策略，可增加外泌体水平2-3倍。

脂质体已知可以与细胞膜相互作用，并通过内吞作用刺激细胞活性，添加中性或阳离子裸脂质体导致外泌体分泌量显著增加（比对照组高3倍）。

磁性纳米微粒的添加可刺激细胞的内吞功能，在没有磁场或有磁场作用的条件下，可增加外泌体表达5~20倍。此外，研究人员通过过表达nSMase、CD9、HIF-1α等基因可显著提高外泌体的表达。

以上这些策略均为来自特定细胞和特定条件下所得到的结果，在参考和借鉴的过程中需要根据细胞类型进行适当调整，同时还应考虑所使用方法或添加在生产条件下的适用性和可放大性，以及增加产量的同时对外泌体性能的影响，需通过综合评估和判断，以选取最优方案。

参考文献

1.Boostingextracellular vesicle secretion. Biotechnol Adv. 2022 May 16:107983.

2.Design strategies and application progress of therapeutic exosomes. Theranostics 2019, Vol. 9, Issue 4.

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