引领高效 RNA 合成：NEB 发布规模化 IVT 技术参考指南

在全球范围内，随着生物医药技术的不断进步，mRNA 技术已成为疫苗开发、创新药物研发领域的的关键技术。NEB 最新发布《Scaling of High-Yield In vitro Transcription Reactions for Linear Increase of RNA Production》技术参考指南，详细介绍了如何通过体外转录（IVT）反应实现高质量 RNA 产物的产量线性放大，满足从实验室到商业规模的 RNA 生产需求。

技术参考指南要点概览

体外转录（IVT）模板策略探针引物设计

介绍了 RNA 合成的起始阶段，如何利用限制酶线性化质粒或通过 PCR 扩增来制备高质量的双链 DNA（dsDNA）模板。

高效 IVT 转录试剂盒及单独酶组分应用

探讨了 HiScribe IVT 高效转录试剂盒&单酶和其他试剂在后续 RNA 合成方案中的应用，并针对 IVT 反应建立及规模化生产中的多个问题和难点以及解决方法进行了实验数据验证。

操作建议与实验验证

中等规模 RNA 合成

技术参考中研究了 HiScribe 试剂在 37°C干燥空气孵育器中的反应体系效果，发现适当地在孵育期间进行混合，可以进一步提高 RNA 产量（见图 1）。

图1：Gentle, intermittent mixing during IVT incubation maximizes yields.

HiScribe reactions (1 ml, 5 kb transcript, expected yield = 9 mg) were incubated for 1 hour at 37°C in a dry air incubator and were either not mixed, mixed after 30 minutes, or mixed every 15 minutes by gentle inversion. Care was taken to ensure no bubbles were introduced during mixing.

T7 RNA 聚合酶用量建议

T7 RNA 聚合酶是体外转录 (IVT) 工作流程中的核心组分，NEB 提供的 T7 RNA 聚合酶有多种规格，满足客户的不同生产需求。为了确定在特定 NTPs 浓度下所需的 T7 RNA 聚合酶单位数，对酶量进行优化是至关重要的。实验显示，对于 5 mM NTPs，使用 100 单位的 T7 RNA 聚合酶（反应中最终浓度为 5 U/µl）对模板进行转录最为合适（见图 2 A）。通过小规模优化体系（20 µl 体系），发现 0.1 单位的无机焦磷酸酶（E.coli）与 20 单位的 RNase 抑制剂（最终浓度分别为 0.005 U/µl 和 1 U/µl）组合使用，能够显著提高 RNA 产量，并且这一方法具有可扩展性（见图 2 B）。

图2：T7 RNA Polymerase titration indicates enzyme amount required to reach maximum yields and demonstrates scalability.

A. In vitro transcription reactions (per 20 µl reaction: 1X RNA Pol Buffer, 5 mM each NTP, 20 mM MgCl2 (total), 0.1 units Inorganic Pyrophosphatase (E. coli) at 37°C for 2 hours) were performed with increasing units of T7 RNA Polymerase to determine the amount of enzyme needed to reach maximum yields. A minimum of 100 units of T7 RNA Polymerase is required to transcribe ~100 µg of CLuc RNA. B. Reaction conditions scaled linearly from 20 µl to 10 ml results in linear RNA yields.

反应体系的线性放大

通过优化模板量、孵育时间等因素，成功地将 HiScribe 高效体外转录试剂盒和单酶试剂的反应体系进行了 1000 倍的线性放大，直至 20 毫升体系。使用 5 kb和 9 kb线性化的双链 DNA 来转录更长的 RNA，证明了从小规模反应到大规模生产的可行性（见图 3）。

图3：IVT reactions can be scaled linearly when using HiScribe kits or individual reactions.

IVT reactions (5 and 9 kb transcripts) were scaled linearly from 20 µl to 20 ml with A. HiScribe components (10 mM each NTP), B. high yield and individual enzymes with 10 mM each NTP, and C. moderate yield and individual enzymes with 5 mm each NTP. R2 > 0.99 for all reactions.

NEB 的承诺与支持

NEB 生产的 HiScribe 高效体外转录试剂盒和多种酶类工具（包括 T7 RNA 聚合酶、无机焦磷酸酶和 RNase 抑制剂）均提供 RUO 和 GMP 级别，为合成各种 RNA 提供了坚实的原材料基础。为了增强 RNA 的稳定性并生产完全功能的 mRNA，NEB 为科学家提供了多种策略的解决方案，包括转录后的 Poly (A) 聚合酶添加、共转录时的加帽或使用 Faustovirus 或 Vaccinia 加帽酶进行转录后加帽，以及加入修饰核苷酸以减少免疫反应。

随着 RNA 作为治疗手段的兴起，NEB 期望本研究指南中的建议能为客户提供 IVT 产量线性放大的思路和方法，帮助他们使用超稳定且一致性佳的试剂，这些试剂可以帮助客户合成大量高质量的 RNA。

NEB 致力于支持 mRNA 合成，提供从模板到转录的全套工具，与您携手共创科技新篇章。

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