基于代谢酶和转运体的体外药物相互作用研究概述与案例分析

来源

中国临床药理学与治疗学，2019 Oct，24（10）：1165-1171

作者

单晓蕾，付淑军，高广花，孙涛，王庆利，余珊珊

国家药品监督管理局药品审评中心

摘要

在药物开发过程中，药物-药物相互作用(DDI)研究是评估新药风险-获益的关键环节。

在评价代谢酶或转运体介导的药物相互作用潜力中，通常体外试验是关键的第一步。体外试验分析结果借助于体外-体内模型公式推算，可决定是否需要以及如何开展临床DDI研究，进而为临床DDI风险控制策略提供参考，包括：药物剂量选择、替代治疗、不同DDI情况下以及不同患者群体的用药禁忌等。

本文概述了药物研发过程体外DDI研究的关键内容，并通过两个案例阐述了体内和体外DDI研究在药物说明书中相关内容的反映。

关键词

药物相互作用；代谢酶; 转运体; 指导原则

1 背景

当今社会人口老龄化导致临床合并用药不断增加，药物-药物相互作用（drug-drug interaction，DDI)研究作为新药安全性和有效性评价的重要环节受到越来越多的关注，其研究结果可能直接影响合并用药的剂量调整，治疗监控策略以及药物的禁忌证，甚至关系到研发新药是否能顺利上市[1]。

药物-药物相互作用研究的内容主要包括，确定药物代谢的主要途径，评估酶和转运体对药物处置的贡献，表征药物对酶和转运体的影响等方面。

一般来说，药物相互作用研究是从体外试验开始，用获取的体外动力学结果与临床药代动力学(PK)数据一起，为确定开展后续临床DDI研究的必要性和试验设计提供信息支持[2]。

国际人用药品注册技术协调会(ICH)三方监管机构[3-6]均发布了药物相互作用研究指导原则。

美国食品药品监督管理局（FDA)于2017年10月修订颁布了《代谢和转运体介导的体外药物相互作用研究的指导原则（草案）》[5]和《临床药物相互作用研究，试验设计、数据分析以及临床意义的指导原则（草案）》[6]，分阶段详细阐述了体内外药物相互作用研究的一般考虑;我国药品监管机构也于2012年发布了《药物相互作用研究指导原则》[7]。

当前我国新药自主研发和全球同步研发深入发展，对我国的药物相互作用研究和评价水平提出了更高的要求。

本文主要参考FDA《代谢和转运体介导的体外药物相互作用研究的指导原则(草案）》（以下简称指南）的相关内容，概述了体外药物相互作用研究的基本策略和试验要素。

该草案的内容将有助于理解新药研发过程中药物相互作用研究的基本策略和监管机构的要求;本文还借助案例分析阐述体外DDI研究对后续临床体内DDI研究的提示作用以及对说明书内容的影响。

本文所提及的基础模型公式以及相关内容均来源于该指南草案所引述的学术文献，因此不再单独标注;另由于篇幅所限，本文未详细阐述机理静态模型和生理药代动力学(PBPK)模型相关内容。

生理药代动力学(PBPK)模型相关内容请收看凡默谷于2019年11月2日将推出的文章：药物相互作用临床研究策略及基于生理的药动学模型应用进展。

2 体外试验系统

2.1 代谢酶

代谢是药物（或前体药物）在体内清除或发生生物转化的重要机制。如果药物对代谢酶具有诱导/抑制作用，或以代谢消除作为体内消除的主要途径，则发生代谢相关的药物相互作用的可能性较大。

通常需要在临床首次人体给药试验前开展体外代谢介导的药物相互作用研究，确定研究药物是否是代谢酶的底物或抑制剂和诱导剂，并确定其抑制/诱导的方式（是否可逆抑制，是否为时间依赖性抑制)等。

药物代谢主要发生在肝脏和肠道，肝脏中药物主要通过细胞色素(CYP)P450酶系代谢，也可通过非P450系统酶，如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyltransferases，UGTs)和磺酸基转移酶（sulfotransferases，SULT) 代谢。

药物代谢相关CYP主要包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5, 其中CYP3A4/5和UGTS在肠道中也有较多分布，与药物的首过效应有关。

在代谢底物检测中，如果研究药物不经以上CYP酶代谢，应考虑药物是否为其他CYP酶(如CYP2A6、CYP2J2、CYP4F2、CYP2E1)、其他I相代谢酶(如MAO、FMO、XO、醇/醛脱氢酶)或是II相代谢酶UGTs等的代谢底物。

人肝细胞、肝微粒和重组酶是体外试验最常使用的代谢酶系统，在多数情况下能够有效地评估药物的体内代谢途径，目前体外DDI研究已建立了针对单个CYP酶的探针底物、抑制剂和诱导剂检测的试验体系[8]。

Tab.1列举了体外试验常用的CYP酶的抑制剂和诱导剂（数据来源于“Guideline on drug interaction for drug development and appropriate provision of information”，MHLW，2019年2月）。

2.2 转运体

转运体分布于人体各组织，可通过调控药物在多个组织器官的吸收、分布和清除对药物的PK-PD特征产生有临床意义的影响。反之，药物也可通过调节转运体的表达或活性，改变体内内源性物质(肌酐、葡萄糖)或外源性物质的分布。

指南中推荐检测的转运体包括ABC族转运体(ABC transporters)和溶质转运蛋白（solute carrier，SLC transporters)两大类。

ABC族转运体直接分解释放ATP进行原发性主动转运，包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer drug resistance protein，BCRP)；溶质转运蛋白包括有机阴离子转运多肽1B1/1B3 (OATP1B1/ OATP1B3,肝的主要转运体）、有机阴离子转运蛋白OAT1/OAT3、多药和毒素外排转运蛋白MATE1和MATE2-K,各转运蛋白的组织分布见Tab.2。

其中，P-gp和BCRP在包括胃肠、肝、肾、大脑等多组织中均有表达，可影响药物的口服生物利用度、组织分布、肝肾清除。

因此，除高溶解和高渗透性药物以外，大部分研究药物均需开展针对P-gp和BCRP的底物研究。

总体来说，当体外试验提示研究药物是某个转运体的底物或抑制剂时，研究者应当综合考虑药物的安全范围、治疗指数、目标人群是否存在与已知某转运体的底物或抑制剂合并用药的可能性，选择开展体内药物和转运体相互作用研究的策略。

用于不同适应症的研究药物，开展体外药物-转运体相互作用研究的时机是不同的。

比如，拟用于心血管、糖尿病适应症人群的药物，很可能存在他汀类药物（已知OATP1B1/OATP1B3的底物）的合并用药，应在开展临床试验前即开展药物与OATP1B1/OATP1B3转运体的相互作用研究。

目前由于缺乏体外转运体诱导试验的可行方法，暂不要求开展转运体诱导研究。

已知常用的非特异性的体外转运体试验系统主要包括:针对P-gp和BCRP转运体的Caco-2人克隆结肠腺癌细胞、膜囊泡、转运体基因敲除/敲减细胞、转染细胞（MDCK、LLC-PK1)等; 针对溶质转运蛋白的肝细胞、转染单个转运体的细胞(CHO、HEK293、MDCK细胞等）。

目前尚未建立起针对某转运体探针底物和抑制剂的特异性试验系统。

Tab.2列举了各转运蛋白已知底物和抑制剂（数据来源于“Guideline on drug interaction for drug development and appropriate provision of information”，MHLW，2019年2月）。

3 试验结果分析

3.1 作为代谢酶底物

代谢酶底物研究的结果分析相对简单。如根据体外研究和人体药代动力学数据，单个代谢酶对药物清除的贡献>25%，通常认为该酶代谢是研究药物清除的重要途径，建议采用该酶的强抑制剂/诱导剂进行临床DDI研究。

3.2 作为代谢酶抑制剂

在代谢酶的抑制剂或诱导剂的结果分析中，需借助模型公式进行预测推算。

首选较为简单保守的基础模型。

若根据预设cut-off标准，提示可能存在临床DDI作用，则需要采用静态机理模型或动态模型（如PBPK模型），或是开展临床DDI研究进一步评估。

针对可逆性酶抑制作用的基础模型计算公式为

通过计算人体游离药物浓度（Imax,u）与药物体外抑制常数(Ki)的比值，推算在存在或不存在抑制剂的条件下合并使用其他药物的系统暴露量(AUC)预测比率(R)。

如果受试物为经口给药，则胃肠道药物的暴露量可能超过系统暴露量，建议采用药物剂量/250mL作为药物的肠腔浓度(Igut)替代系统暴露浓度（Imax,u），则公式修改为

当值R值≥1.02或Rgut 值≥11，建议开展进一步DDI研究。

对于时间依赖性酶抑制作用的评估较为复杂。由于酶失活引起酶功能的动态改变近似于一个简单的动态方程，基础模型参数包括了降解速率常数(Kdeg)，表观失活常数（KI)和最大失活速率(Kinact)，计算公式为

此处

当R值≥1.25，建议采用PBPK模型或开展临床DDI试验进一步评估药物相互作用的可能性。

3.3 作为代谢酶诱导剂

在伴随其他酶抑制作用时，如果仅检测酶的活性，可能掩盖酶诱导作用，因此推荐以底物探针的mRNA水平和/或酶活性作为检测指标评估酶诱导作用。

此外，由于CYP3A和CYP2C酶诱导均依赖于孕甾烷X受体(pregnane X receptor, PXR)的活化，因此在研究起始阶段可仅评估药物对CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4/ 5的作用，若CYP3A结果为阴性，可不必对CYP2C进行研究。反之，则需检测药物对CYP2C的诱导作用。

酶诱导作用基础模型计算公式为

其中EC50为半数效应浓度，Emax为最大诱导效应，Imax,u为最大血浆游离药物浓度，d为换算系统（通常设为1），如R值≤0.8，提示可能存在临床DDI的风险。

此外，用于评估酶诱导作用的基础模型还包括:

（1）差异倍数分析法（fold-change method): 

通过使用已知阳性和阴性对照品确定的cut-off值来校准系统，检查与研究药物共培养时CYP酶的mRNA水平的差异变化倍数。若在研究药物存在的情况下，酶的mRNA水平增加至2倍及以上，同时阳性对照反应率>20%认为是阳性反应。

（2）相关性法（correlation methods):

直接计算Imax,u/EC50比值或是计算相对诱导分数

根据对同种酶的一系列已知诱导剂的RIS诱导分数或Imax,u/EC50比值的校准曲线，确定临床诱导效应的大小（例如，在存在和不存在诱导剂时探针底物AUC的比率)。

3.4 作为转运体底物

对于P-gp，若药物的净流量比（或称外排比Efflux ratio) ≥2,并且外排作用可被至少一种已知抑制剂明显抑制时，提示研究药物可能是P-gp转运体的底物。

对于肝脏摄取蛋白（OATP1B1、OATP1B3)和肾脏分泌蛋白(OAT1/OAT3、OCT2、Matel、Mate2-K)，如转运体转染细胞的摄取高于空白转染细胞的2倍及以上，且摄取可被已知抑制剂明显抑制，提示药物可能是其底物。

3.5 作为转运体抑制剂

对于P-gp和BCRP，体外研究应确定药物对P-gp或BCRP底物的净流量的抑制效力（即IC50或Ki)并计算Imax与IC50比值，若为口服药物，则采用Igut (Igut=药物摩尔质量/250mL)，当计算得到Igut/IC50≥10时，认为药物可能产生抑制作用，但研究者可采用已知的抑制剂或非抑制剂校正体外试验系统，根据合适理由选择cut-off值。

对于OATP1B1和OATP1B3，由于口服药物可经门静脉到达肝脏，因此肝脏血浆药物浓度可能高于系统暴露量，因此，肝入口最大抑制浓度计算公式为

基础模型计算公式为

以上Ka，FaFg, fu,p, Qh, RB分别表示吸收速率常数、肠道生物利用度、血浆游离药物、肝脏血流分数和全血-血浆比值。

当值R>1.1，提示研究药物可能对OATP1B1/OATP1B3具有抑制作用。

药物对肾分泌蛋白OAT1/OAT3/OCT2和MATES的抑制作用，采用Imax,u与IC50比值进行计算评估，当Imax,u/IC50≥0.1 (对OAT1/OAT3/OCT2)或≥0.02(对MATES), 提示研究药物对以上转运体具有体内抑制剂作用。

值得注意的是，内源性肌酐也是肾转运体OTC2、MATES、0AT2的底物，如果研究药物为以上肾转运体的抑制剂，则可能导致血清肌酐水平的异常升高，需在临床阶段进一步开展体内DDI机制研究。

4 对代谢产物体外DDI研究的考虑

与原型药物相比，一些极性更强的代谢产物可能成为更好的酶或转运体的底物或抑制剂，临床上导致DDI的几率更高。

一般认为，如果代谢产物的血浆暴露显著或具有明显的药理活性（占总体活性>50%)，或者具有警示结构，如存在时间依赖的定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR)，需要具体情况来决定是否开展代谢产物与酶和转运体的体外相互作用研究。

建议使用纯化或合成的代谢产物标准品或者采用放射同位素标记药物开展体外试验。

药物代谢产物的结果分析一般采用与原型药物相同的原则和策略。

5 药物相互作用研究案例

下文列举了2个FDA批准上市药物开展药物相互作用研究的案例。

2个案例均从体外试验开始，借助基础模型进行分析，预测药物可能存在与CYP酶或转运体BCRP的相互作用，提示需开展临床DDI研究，最终经临床试验证实或未经临床证实将相关风险纳入说明书【药物相互作用】项下，体现了新药研发过程中药物相互作用研究和风险评估的基本思路。

案例1:

克唑替尼胶囊[9]是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，于2011年在美国上市，用于治疗间变性淋巴瘤激酶（ALK)阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC)，口服给药，200mg/次，每日2次。

体外药代研究结果显示[10]，CYP3A4/5是克唑替尼的主要代谢CYP酶，约占肝脏清除率的84%~99%(>25%)。

体外试验结果显示，克唑替尼对CYP3A具有抑制作用，以非洛地平和睾酮作为底物得到Ki分别为7.3μmol/L和8.2μmol/L，按临床试验中克唑替尼稳态血浆暴露水平为0.91μmol/L，计算I/Ki比值分别为0.11和0.13(>0.1，为FDA2012版药物相互作用指导原则中结合+游离药物的cut-off标准），提示可能存在体内药物相互作用。

临床DDI研究结果显示，克唑替尼（每日两次，每次250mg，连续服用28d)与咪达唑仑(CYP3A的底物）合用，咪达唑仑AUCinf增加了3.7倍，提示克唑替尼是CYP3A的中度抑制剂。克唑替尼单剂量口服150mg，合并CYP3A强抑制剂酮康唑(200mg，每日两次），与单独服用克唑替尼相比，联用后克唑替尼AUCinf和Cmax值分别增加约3.2倍和1.4倍; 克唑替尼（250mg，每日两次)合用CYP3A强诱导剂利福平（600mg，每日一次），与单独服用克唑替尼相比，克唑替尼的稳态AUCtau和Cmax分别降低84%和79%。

因此，说明书中【药物相互作用】项[9]提示内容为:克唑替尼与细胞色素P450(CYP)3A强抑制剂合用可能会导致克唑替尼血药浓度升高，应避免合并使用下列CYP3A强抑制剂（包括但不限于）：阿扎那韦、克拉霉素、印地那韦、伊曲康唑、酮康唑、奈法唑酮、奈非那韦、利托那韦、沙奎那韦、克拉霉素、泰利霉素、醋竹桃霉素和伏立康唑。

与CYP3A强诱导剂合用可能会导致克唑替尼血药浓度降低。应避免合并使用下列CYP3A强诱导剂（包括但不限于）：卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、利福平、利福布丁和圣约翰草。

服用克唑替尼的患者应避免合并使用治疗指数较窄的CYP3A底物，包括但不限于阿芬太尼、环孢霉素、双氢麦角胺、麦角胺、芬太尼、匹莫齐特、奎尼丁、西罗莫司和他克莫司。

如果需要合并用药，可能需要减少CYP3A底物的剂量，避免产生不良反应。

案例2: 

沙芬酰胺[11]是一种选择性和可逆的MAO-B抑制剂，可增强大脑中多巴胺能神经传递，于2017年在美国上市，批准联合固定剂量的左旋多巴（L-多巴）单药或其他帕金森药物用作中晚期症状波动特发性帕金森病(PD)成人患者的辅助治疗，口服给药，起始剂量为50mg/日，可根据需求增加剂量至100mg/日。

沙芬酰胺的主要代谢产物为:酰胺基水解（NW-1153)和氧化性N-脱烷基化（NW-1689)。

体外研究显示[12]，沙芬酰胺及其代谢产物NW-1689对BCRP介导的PhIP转运有抑制作用，IC50分别为（43±23)μmol/L和（3.7±0.5)μmol/L。

本案例中，沙芬酰胺为口服药物，肠道药物浓度高于血液浓度，使用的基础模型计算公式为R=1+Igut/IC50。

当R值≥11，即药物肠道浓度Igut≥10倍IC50(即（430±230)μmol/L)时，提示需进行体内DDI研究。

综合考虑胃肠道的动态吸收(血液达峰时间为1.8~2.8h)因素，根据血药浓度推测出沙芬酰胺在≤50mg/日剂量下，肠道药物浓度应低于（430±230)μmol/L)，但沙芬酰胺每日最高剂量为100mg/日，该剂量下肠道药物浓度应高于（430±230) μmol/L)，因此需进行临床DDI研究。

NW-1689作为沙芬酰胺的主要代谢产物，在临床最大剂量100mg/日水平时，患者平均血浆最大暴露浓度约为4μmol/L，R值(R=1+Imax/IC50)大约为2.25(>1.1，采用FDA2012版药物相互作用指导原则cut-off标准），提示应进行临床DDI研究。

从FDA公布的审评资料看，申请人后续并未提供符合要求的临床DDI研究资料，FDA因此直接在说明书【药物相互作用】项下[11]增加了相关风险描述，即沙芬酰胺和其主要代谢产物可能引起BCRP底物浓度的增加，如果同服可能增强以下药物的药理作用或不良反应，BCRP底物包括甲氨蝶呤、米托蒽酿、伊马替尼、拉帕替尼、罗素伐他汀、柳氮磺胺吡啶和拓扑替康等。

6 小结

药物相互作用研究通常始于体外试验，再结合体外动力学结果与临床药代动力学数据共同为后续临床DDI研究的必要性和合理设计提供信息支持，其研究结果还将直接决定药物说明书中的安全性提示的内容和质量。

药物相互作用研究是药物安全有效性评价的重要内容，贯穿于整个药物研发过程。

近年来，我国药物相互作用研究方面的体外试验和模型分析水平均有了长足的进步，但临床非预期的药物相互作用仍有发生。

如何从体外试验数据准确预测临床药物相互作用，如何借鉴国外已有的技术方法和监管理念，快速提升和完善自身研究和评价水平是我国新药研究者和监管机构应积极思考和实践的课题。

参考文献

详见 中国临床药理学与治疗学，2019 Oct，24（10）:1165-1171