被人忽视的非水反相色谱法

反相色谱法中有种特殊的模式非水反相色谱法，在平时工作中应用较少。但是非水反相色谱法能对疏水性很强、不溶于水样品分离有很好的作用，本文对非水反相色谱法进行介绍，并对其使用范围进行汇总分析。

1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。色谱法是一种分离方法，它的特点是有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。色谱法能够分离的原理是利用被分离的物质在互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。按流动相状态的不同，可分为：气相色谱法(GC)，液相色谱法(LC)，超临界流体色谱(SFC)。液相色谱法按固定相状态的不同可分为：液固色谱(LSC)，液液色谱(LLC)。化学键合相色谱法（采用化学键合相作固定相的液相色谱法）是液相色谱法基础上发展起来的，是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体(硅胶)表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。化学键合相色谱所用流动相的极性须与固定相显著不同，根据键合固定相和流动相相对极性的强弱 ，可将键合色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。在正相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物；在反相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，适用于分离非极性物质。在《现代液相色谱技术导论》第三版中，根据分离的模式或本质将色谱模式分成以上几种。

在上表的色谱模式中，反相色谱是目前最常用的模式。反相色谱法使用非极性的固定相或者色谱柱（如C18）和极性的流动相。极性的溶质分子喜欢极性的流动相（物以类聚）且保留程度比较低，而非极性的溶质分子会倾向和非极性的固定相相互作用并能保留更久。反相色谱法中易忽略的模式非水反相色谱（NARP），色谱柱是非极性（如C18），流动相顾名思义非水全部由有机相组成。非水反相色谱（NARP）中主要用来分离疏水性很强的样品，这些样品的保留能力很强，如脂类、合成聚合物等。非水反相色谱中的流动相是由极性较强的有机溶剂A和极性较弱的有机溶剂B组成。通常A溶剂常用的是乙腈或甲醇，B溶剂是四氢呋喃、异丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或者其他极性较弱的有机溶剂。样品保留是通过改变%B或B溶剂的极性来控制的。可以通过下表的p’值近似估算溶剂的极性。

反相色谱法的保留机制长久以来都是研究重点。溶质分子在固定相的定位可能有几种形式存在，如疏溶剂作用、吸附作用、分配作用等。疏溶剂相互作用假定了溶质分子与配合基对齐并且附着在它上面。吸附意味着溶质分子并没有渗透到固定相里面而是保留在固定相和流动相液体之间。分配作用为固定相和液体类似，溶质分子溶解在里面。见下图。

其中疏溶剂的作用是接受比较广的理论：相对而言，疏水性的溶质分子比较喜欢吸附在疏水性的烷基基团上，因此也叫疏水性保留。反相色谱法中键合的烷基等非极性固定相，流动相为水、有机溶剂、缓冲液等极性溶剂。键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值越大；流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强，溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质保留值越大。溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。

对于非水反相色谱法，原理和反相色谱法一致。固定相为非极性固定相。样品由于疏水性较强，保留较大，不采用强极性水溶液作为流动相，全部由有机溶剂组成。

非水反相色谱法方法优化同反相色谱法，主要通过改变%B或B溶剂的极性来调节，等度或梯度都能使用，同时柱温对样品的分离也有影响。一般采用首选采用ACN（A）和THF（B）的混合溶剂为作为初始流动相。若用100%THF样品保留仍太强，可以用极性较弱B溶剂（如二氯甲烷或氯仿）来替换，但是应考虑使用二氯甲烷或氯仿的检测波长。

下表对使用非水反相色谱法检测文献进行归纳整理。图片从上表可以看出非水反相色谱法主要集中应用于脂溶性、疏水性很强的化合物和一些非极性含氮有机化合物。脂溶性药物极性小，不溶于水，有时甚至在甲醇中也难溶，一般采用正相色谱法和气相色谱法。正相色谱法和气相色谱法均有优缺点，可以考虑使用非水反相色谱进行检测。制剂中的一些水溶性成分或某些辅料不溶于有机相，对测定影响小。文献中还报道了非水反相色谱法分离测定了几种非极性含氮有机化合物及其盐类药物，有可能为非水反相色谱法非水体系减少了样品的电离，减少含氮基团与固定相残留硅醇基的作用，改善峰形。

在《Quantification of pentaerythritol tetrastearate，a mold release agent used in polycarbonate, by non‐aqueous RP HPLC method》中，聚对苯二甲酸乙二醇酯为一个高分子量和强疏水性物质，气相和正相色谱均不能检测其含量，采用NAPR梯度和蒸发光散射检测器的方法很好的解决了高分子量和强疏水性的问题。这为相似的化合物的检测提供了解决思路。从上表可以看出非水反相色谱法主要集中应用于脂溶性、疏水性很强的化合物和一些非极性含氮有机化合物。脂溶性药物极性小，不溶于水，有时甚至在甲醇中也难溶，一般采用正相色谱法和气相色谱法。正相色谱法和气相色谱法均有优缺点，可以考虑使用非水反相色谱进行检测。制剂中的一些水溶性成分或某些辅料不溶于有机相，对测定影响小。文献中还报道了非水反相色谱法分离测定了几种非极性含氮有机化合物及其盐类药物，有可能为非水反相色谱法非水体系减少了样品的电离，减少含氮基团与固定相残留硅醇基的作用，改善峰形。

非水反相色谱法同时具有一定的局限性。由于流动相全为有机相，只能适用于疏水性强，溶于有机溶剂的样品。如果检测器为紫外检测器，流动相如二氯甲烷等需要注意使用的检测波长不能采用低波段。在使用非水反相色谱法时，需要将整个系统和色谱柱的水相彻底冲洗。

非水反相色谱法为反相色谱法的一种特殊模式，色谱柱同反相色谱法常用的非极性色谱柱，流动相全为有机相，样品保留是通过改变极性较弱溶剂的极性来控制；主要分离疏水性很强、不溶于水的样品。在平时工作中，遇到类似物质可以考虑使用非水反相色谱法，不拘泥于紫外检测器，如上文提到的检测聚对苯二甲酸乙二醇酯采用蒸发光散射检测器，同时还有报道采用LC-MS联用等。

本文为笔者学习《现代液相色谱技术导论》第三版及一些文献整理的读书笔记，如有错误，敬请指出。感谢雷诺岛对本文的编辑。

参考文献

1. 人民卫生出版社 《现代液相色谱技术导论》第三版

2. 郝晓花 非水反相液相色谱法在中药质量控制中的应用

3. 刘红菊 非水反相高效液相色谱法在非极性药物分析中的应用研究

4. 刘红菊，蒋 晔，郝晓花 非水反相高效液相色谱法测定阿立哌唑的含量

5. Polasa Indira ，Kumar Arun ，Narayana Ramesh ，Quantification of pentaerythritol tetrastearate，a mold release agent used in polycarbonate by non‐aqueous RP HPLC method