临床应用和临床试验中的脂质体纳米粒（一）：脂质体概述

脂质体纳米粒在临床应用方面取得了极大的成功。无论是已经上市了二十余款小分子给药系统制剂，还是近期RNA疫苗研制中发挥的关键作用，都显示出脂质体在药物应用领域的巨大潜力。该篇综述首先对脂质纳米粒及其结构性质关系进行概述，然后聚焦于脂质体纳米粒在临床中的应用。本文为第一部分，概述了脂质体纳米粒的发展历程、分类。

本文译自Thai Thanh Hoang Thi 和 Nghia P. Truong et al. Lipid-Based Nanoparticles in the Clinic and Clinical Trials: From Cancer Nanomedicine toCOVID-19 Vaccines，Vaccines 2021, 9, 359 （1.Introduction和2.1. Overview of Lipid-Based Nanoparticles）

纳米药物是纳米技术、药学和生物医学科学的融合，并随着用于疾病治疗、显像剂和治疗诊断应用的新型纳米制剂的设计而迅速发展。美国食品和药物管理局（FDA）对纳米制剂的定义是与1-100纳米（nm）范围内的纳米颗粒组合的制剂；或尺寸在此范围之外却显示出尺寸相关特性的制剂型式。与游离药物分子相比，这些制剂具有许多优点，增加了溶解度、药代动力学和疗效得到改善、毒性最小化。已经上市的纳米药物已经有50中，包括多种纳米制剂，脂质纳米粒是其中的佼佼者。脂质纳米粒是多组分脂质系统，通常包含磷脂、可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。传统类型的脂质纳米粒是指脂质体，由英国血液学家AlecD Bangham在1961年首次提出。通过采用负染剂染色磷脂，可以在电子显微镜下观察脂质体。这些磷脂组成磷脂双分子层，进而形成球形。随后，在1980年，第一种由活性靶向配体修饰的靶向脂质体被开发出来，其可以增加药物在靶组织器官细胞中的累积，使药物不会释放到其他部位，这使得脂质体的能力大大提高。与传统脂质体相比，这些脂质体的总体疗效得到改善。尽管经过30年的探索，脂质体已经可以作为多种药物分子的有效载体，但直到20世纪90年代，美国食品和药物管理局（FDA）才首次批准脂质体药物。这一里程碑是Doxil，它是一种包裹阿霉素的“隐形”脂质体（图1a），其用于卵巢癌和转移性乳腺癌以及各种形式的骨髓瘤的临床治疗。由于阿霉素被包裹在聚乙二醇脂质体中，游离阿霉素的副作用（包括慢性心肌病和充血性心力衰竭）显著减轻。此外，Doxil中的聚乙二醇化脂质体可以延长该药物给药后在血液中的循环时间。在此之后，被动靶向至肿瘤。总的来说，由于增强渗透和滞留（EPR）效应，Doxil与游离阿霉素相比，显著降低心脏毒性并增强抗癌能力。

21世纪以来，多组分制剂出发发生了根本改变，纳米制剂取得极大的进展。这些多组分处方开始用于传递基因治疗药物寡核苷酸。这些寡核苷酸是大分子，表现出比常规化疗更高的治疗指数，特别是当这些制剂通过特殊设计时，可以到达特定组织时。基因传递面临的主要挑战是裸核酸在生理介质中的不稳定性。因此，开发合适的处方以保证其足够的体内稳定性和组织靶向能力至关重要。这一进步是在2018年取得的，FDA批准了Onpattro（AlnylamPharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA, USA）和SanofiGenzyme（Cambridge, MA, USA），由脂质体纳米粒子（LNPs）包裹siRNA而获得（图1a），用于治疗遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性患者的多发性神经病。该LNP由DLin-MC3-DMA脂质（结构见图1b）、二聚芳基磷脂酰胆碱（DSPC）、胆固醇和PEG脂质（PEG-DMG）组成，PEG脂质在体内将颗粒靶向肝细胞。在酸性介质（pH~4）中，LNP中的阳离子脂质体可以通过静电作用与核苷酸形成复合物。在生理pH值7.4，该制剂会带中性电荷，从而更隐蔽，从而抑制与其血液成分的相互作用。当这些LNP被细胞内化时，这些结构脂质带正电，从而促进其与带负电的内溶酶体膜的复合。这种与细胞组分的相互作用会破坏脂质体并将核酸释放到胞浆中，从而发挥作用。研究表明，可电离脂质的结构和pKa对药物向靶细胞的输送效率有至关重要的作用。例如，Onpattro中的可电离脂质（Dlin-MC3-DMA）（图1b）的pKa为6.44，其药物递送效率比pKa为6.7的Dlin-KC2-DMA高10倍。然而，应注意的是，脂质结构的细微差异可导致LNP的组装结构发生变化，从而导致不同的形态和药物递送情况。为了提高颗粒稳定性，处方中加入了具有两个饱和酰基链和一个大头基的DSPC（图1b）。这些脂质产生圆柱形几何形状，并在LNP中发挥辅助脂质的作用，以维持外层结构并促进Onpattro的形成。颗粒表面的PEG-DMG脂质（图1a，b）由于隐形特性防止颗粒聚集，并延长体内循环时间。总之，这种LNP系统具有坚实的核心结构、生理介质中的低表面电荷和低免疫原性。这项技术引发了人们对进一步开发基因疗法和新型给药系统的兴趣。脂质纳米粒是一种特别有前途的基因传递载体，其生物相容性高于聚合物纳米粒和无机纳米粒，具有固有的渗透能力、生物降解性、结构灵活性和低免疫原性。这些纳米结构也可以快速大规模生产，这是进入临床试验和商业应用的一个主要优势。

自从Doxil、Onpattro和各种其他LNP在临床试验中取得成功以来，已经开展了大量研究，将研发成果转化为商业产品。本综述介绍了FDA批准的各种脂质纳米粒，并提出我们对未来发展机遇和挑战的看法。特别地，我们首先对脂质纳米粒及其结构性质关系进行概述。然后，我们研究了已成功用于癌症药物输送的脂质纳米粒。我们还讨论了更具挑战性的遗传物质的传递，以及它在预防性病毒疫苗和治疗性癌症疫苗（包括免疫疗法）中的应用。

根据制备方法和制剂的物理化学性质，脂质纳米粒可分为5类。它们是脂质体（liposome）、非离子表面活性剂脂质体（niosome）、转移体（tansfersome）、固体脂质纳米粒（SLN）和纳米结构脂质载体（NLC）。图2和表1描述了每种类型颗粒的主要特性。简言之，由磷脂和胆固醇构成的脂质体具有强大的药物保护能力和靶向能力。与处于循环系统的游离药物相比，这些特性使得脂质体具有更低的毒性和更好的疗效。但是脂质体在角质层中缺乏穿透能力，其在皮肤给药中的应用受到了限制。其他缺点包括亲水性药物的包封性差，以及由于药物在介质中泄漏而导致的储存稳定性差。非离子表面活性剂脂质体（niosome）的是一种脂质体的类似物，是由非离子表面活性剂和胆固醇在水相条件下形成的脂质体，它比脂质体具有更好的稳定性和更长的货架期。此外，与带正电的脂质体相比，它们的中性壳具有相容性。尽管具有优越的性质，但由于缺乏离子排斥作用，非离子表面活性剂脂质体也会发生药物泄漏和颗粒聚集，这一直是FDA批准的障碍。转运体是由磷脂、边缘激活剂（EA）和胆固醇组成的弹性或可变形纳米颗粒。EA的加入增强了它们的柔韧性，促进了其组织渗透性。转运体包载亲脂性分子时，具有最高的穿透能力和包封效率。它们的氧化降解和高昂的材料成本仍然是大量生产此类颗粒的挑战。所有这些具有亲水核的亲脂性双层多层纳米颗粒都能够在没有化学干预的情况下包载亲水性和疏水性药物。疏水性药物优先夹在外部双层中，而亲水性分子则进入水腔中（图2）。因此，这些颗粒被认为是广谱药物的有效载体，能够对药物提供足够的保护、实现可持续的药物释放和提高的生物利用度。

脂质体的稳定性有限、毒性、低载药能力和复杂制造相关的缺点引起了研究人员的兴趣，致力于开发了一类旨在提供包载效率的新型颗粒。固体脂质纳米粒（SLN，图2）由固体脂肪和表面活性剂制成，形成具有固体脂质核和单层壳的球形纳米粒。与脂质体相比，因为固体脂质纳米粒没有亲水核，对疏水性药物的包封效率更高。与脂质体和聚合物纳米颗粒相比，这种刚性核还提高了SLN的稳定性。事实上，水介质中的SLN至少可以储存3年。SLN的生产不需要有机溶剂，从而消除了溶剂残留引起的毒性风险。此外，SLN可以实现大规模生产的能力和良好的重现性是下游商业和临床应用的重要特性。在SLN之后，纳米结构脂质载体（NLC）已被开发用于增强药物包载和防止药物泄漏。NLC由非结构脂质内部和单层表面活性剂外围组成（图2）。与SLN由于固体晶格导致载药量趋于饱和不同，NLC的核心由固体和液体脂质的混合物构成，形成不完美的内部结晶可以增加载药量。此外，NLC中的这种液相可以在储存期间抑制药物释放。

此外，脂质-聚合物杂化纳米颗粒也得到了研究，以实现脂质基纳米颗粒和聚合物颗粒之间产生协同作用。事实上，张等人比较了用于包载顺铂的脂质纳米粒、聚合物纳米粒和二者的杂化纳米粒，体内数据表明载顺铂的脂质-聚合物杂化纳米粒能最有效地抑制卵巢癌。此外，在基因传递应用中也考虑了这些杂化粒子。通过优化脂质纳米粒的性质，可以控制其安全性、包封能力、稳定性、药代动力学、生物分布和治疗获益。

对于寡核苷酸的递送，纳米颗粒需要包载足量的核酸，并具有特定的组织靶向性。因此，对脂质纳米颗粒的优化是调控药物递送至不同部位的关键。结构决定因素，如粒径、表面电荷、聚乙二醇化和表面修饰的靶向配体，已证明是决定这些纳米颗粒输送效率的关键因素。

小尺寸纳米颗粒已被证明有助于血液和毛细血管中的运输以及组织的摄取。更具体地说，粒径小于10 nm的纳米粒子最适合扩散到毛细血管中，而10~100nm的颗粒更倾向于通过对流被毛细淋巴管吸收。当尺寸为100~200nm时，其快速扩散的能力降低。Oussoren等人的一项研究证明，皮下注射后，40nm脂质体比粒径更大的粒子具有更高的淋巴吸收。这些被注射的40nm脂质体有76%被淋巴结摄取，而较大粒径的脂质体则被保留在皮下注射部位。对于肝靶向，系统给药后，只有100nm的颗粒能够通过肝窗扩散到肝细胞和肝星状细胞。这些结果表明，小尺寸脂质体可增强淋巴结转移能力，并可穿透肝窗以靶向肝细胞。对于大尺寸脂质体（＞150nm），这些纳米粒子被注射部位的抗原呈递细胞（APC）吸收，然后被运送到淋巴结。已有研究表明它们在淋巴结内获得了更高的细胞亲和力。

就脂质纳米粒的电荷效应而言，很难得出一般结论。Mai等人报道称，在微血管网络内，阴离子和阳离子脂质体与B细胞的结合程度明显高于不带电荷的脂质体。这一现象可以用类似的阴离子、阳离子脂质体外壳的补体蛋白能够与B细胞相互作用来解释。阳离子脂质体与B细胞受体的相互作用和内化程度最高。阳离子脂质体在血液中被调理素修饰，从而被人体免疫细胞识别。阴离子脂质体主要附着在B细胞表面。这一发现表明，荷电脂质体可能适合于疫苗应用，而中性粒子可能更适合于化疗药物的递送。中村等发现30nm带负电的LNP能够比带正电和中性粒子更有效地靶向淋巴结。结果表明，淋巴结中20~30%的B220+细胞被中性和带正电的LNP标记，而几乎80%的B220+细胞被带负电的LNP标记。与中性和阴离子粒子相比，阳离子粒子在注射部位的保留更为明显。这种效应是由于阳离子LNP和带负电组织之间的高静电相互作用。此外，据报道，阳离子LNP与血浆蛋白非特异性结合，并与较高的免疫原性有关。综上所述，带正电的LNP具有很强的细胞亲和力，但功效有限，而带负电的LNP则能被有效地转运到淋巴结。为了利用这种电荷特性，Hirai等人设计了电荷可逆LNP，这使得其在基因传递方面可以实现两全其美。这些LNP由二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、胆固醇和二油酰甘油磷酸二乙二胺结合物（DOP-DEDA）组成，在pH值为6.0时带正电，在pH值为7.4时带中性，在pH值为8.0时带负电。该系统在血液中是中性的，以最大限度地减少血浆蛋白的降解，并保护包裹的药物。当在血液中循环时，这些DOP-DEDA-LNP载体在其疏水性脂质区域与载脂蛋白（如apoE3）结合，从而促进癌细胞通过网格蛋白和小窝介导的内吞途径摄取它们。在内溶酶体中，pH值较低，这导致DOP-DEDA脂质纳米粒带正电荷，以增强靶细胞中的细胞溶质渗透（图3）。这些具有pH依赖性电荷转化特性的LNP被认为是诱导RNAi介导的基因沉默的安全有效载体。LNPs效力的另一个重要决定因素是脂质pKa。一系列研究表明，pKa为6.4是最大化siRNA LNPs转染的最佳选择。根据mRNA的情况，这种最佳pKa也发生了变化，最佳范围为6.6~6.8。

作为一种提高靶向能力的策略，聚乙二醇化的脂质的纳米颗粒获得了极大的研究兴趣，其可以减少血液中颗粒的清除，从而增加其在靶向组织器官的滞留和吸收。Moghimi的研究表明，与裸脂质体相比，PEG修饰阴离子脂质体能够在皮下给药部位获得更好的清除率和在淋巴结中更高的保留率。就PEG长度而言，与较长的PEG修饰脂质体相比，较短的PEG链获得较低的清除率，但在淋巴结中的保留率较高。在结构方面，有报道表明，使用线性或支化PEG链可以显著决定LNP的靶向行为和转染能力。Truong课题组用吐温80、吐温20和1,，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）制备的脂质体包载pDNA，并研究其靶向性、稳定性和转染程度。与DSPE-PEG的线性结构相比，Tween20和Tween 80这两种非离子表面活性剂均由具有类似支化PEG结构的饱和碳尾制成（图4）。尽管存在这些结构差异，LNP在3周内表现出类似的稳定性。体内转染研究表明，具有较短的PEG的吐温20的颗粒能够更有效地靶向淋巴结。另一方面，具有较长的PEG的吐温80形成靶向脾脏的LNP，但效率较低。带有线性DSPE-PEG的LNP主要在注射部位显示出局部转染。总之，这项研究表明，用支化PEG对LNP进行聚乙二醇化是一种可行的方法，可选择性地有效转染靶器官。据推测，除了分子量和结构外，颗粒上的PEG密度也是一个重要因素。在三种类型的LNP中，带正电的脂质纳米粒的聚乙二醇化与裸纳米粒相比有很大差异。聚乙二醇化可防止带正电的脂质纳米粒在给药部位的高滞留。虽然聚乙二醇化已被证明有助于防止颗粒从体循环中过早清除，但抗聚乙二醇抗体的产生已成为有害的共侧损伤。最近，人们致力于采用具有生物相容性的聚合物的替代策略，以防止在第一次给药后产生抗PEG抗体，否则会导致治疗效果丧失，并可能对后续剂量产生不利影响。同时，Chen等人发现，在脂质纳米粒中加入4mol%地塞米松能够抑制注射后的免疫反应和抗体产生，这可能有助于开发聚乙二醇化脂质纳米粒载体。

除了依赖于长时间循环和细胞被动摄取纳米颗粒外，制剂科学家已经认识到，通过将受体配体结合到颗粒表面，可以增强对靶细胞的摄取。用靶向配体修饰脂质纳米粒是有效地将给药系统靶向淋巴结或其他所需组织细胞的关键策略。例如，Vu等人使用血凝素抗原（HA）将脂质体表面功能化，以提高抗体产生效率。这项工作表明HA功能化脂质体能够穿过淋巴结中的屏障细胞，增强生发中心的形成和卵泡辅助性T细胞免疫。通过共价键极爱那个单克隆抗体（MAB）结合到纳米颗粒表面，进而靶向白细胞，也是一种有希望的途径。Veiga等人将抗Ly6C抗体与载有siRNA的脂质纳米粒结合，形成ASSET平台（锚定二级单链抗体，实现靶向性）。如其他研究所示，该制剂能够在体内选择性地靶向炎症白细胞。同样，实体瘤的p32表达水平通常高于非癌组织。为了利用这一点，已经开发出linTT1（AKRGARSTA）和LyP-1肽，它们能够以强亲和力与p32结合。因此，这些肽被用作肿瘤归巢的靶向配体。事实上，亨特等人将linTT1用作腹膜癌病的靶向配体，发现这些纳米颗粒在小鼠腹膜肿瘤中的吸收程度比非靶向颗粒更大。Slik等人在体内外研究中还证明了使用linTT1作为配体的肿瘤靶向显示出类似的结果。对于神经系统疾病的治疗，以神经系统为靶点是必要的。Kuo等人设计了一种被Ln5-P4（PPFLMLLKGSTR）肽（Ln5-P4-ASLNs）的修饰的两亲性固体脂质纳米粒的处方，用于共同输送神经生长因子（NGF）和维甲酸（RA）。Ln5-P4结合α3β1整合素，支持细胞粘附和扩散，引导诱导的多能干细胞向神经元分化。该制剂被证明可以提高诱导多能干细胞的存活率和成熟神经元的生成，可作为再生医学中神经退行性疾病和神经损伤的潜在治疗方法。在其他研究中，通过将狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽（狂犬病病毒糖蛋白的一个片段）附着在包载siRNA的囊泡表面，提高了对神经细胞的选择性。该制剂在阿尔茨海默病小鼠模型中显示出积极作用。为了增强树突状细胞的细胞摄取以增强免疫反应，脂质纳米粒已与细胞穿透肽（如R8和GALA）结合。树突状细胞受体和肝细胞的许多其他配体已开发用于靶向目的。融合肽（如DOPE）也能改善膜融合，从而提高细胞摄取。转铁蛋白、叶酸和抗体可以用作脂质纳米粒的配体，以靶向癌细胞受体。为了提高siRNA转染率，将Niemann-Pick型C-1蛋白（NPC-1）抑制剂NP3.47与脂质纳米粒表面结合。NP3.47促进了siRNALNPs在晚期内体溶酶体中的积累，比未修饰的脂质纳米粒高出3倍。由于NP3.47-LNP-siRNA纳米粒在晚期溶酶体中的捕获增加，这可以增加其从溶酶体中逃逸的机会，从而实现siRNA和其他寡核苷酸的传递。

近年来，脂质纳米粒已成为将药物递送至靶细胞的最有效载体，并已在临床上取得成功。在此之前，已有综述对分析表征、基本技术概念和要点详尽的总结。本篇综述将集中于脂质纳米粒在临床上的应用。