文献解读 | 革命性突破！实验室培育出可移植的iPSC衍生造血干细胞

iHSC

诱导多能干细胞(iPSC)衍生造血干细胞(HSC)为多种血液病的治疗开辟了新途径，在生物医学领域展现出重要应用潜力。例如，利用患者特异性诱导多能干细胞(iPSC)衍生HS C能够规避因供体与受体之间的HLA不匹配而引发的移植物抗宿主病(GVHD)。此外，将基因修饰技术与iPSC相结合可以根据血液疾病的遗传病因(例如骨髓衰竭综合征)进行治疗以及建立体外疾病模型模拟异常造血过程，利于开发更为有效的治疗方案。

该研究建立了一种iPSC分化造血细胞实验方案，该方案产生的CD34+造血细胞能在免疫缺陷小鼠体内实现多谱系造血移植（MLE），研究人员将这些具有MLE能力的iPSC衍生造血细胞称为“iHSC”。

实验通过将人源iPSC（(形成拟胚体（EB））置于含有视黄醇乙酸酯（RETA）的特定培养体系中，通过诱导HOXA基因特定的表达模式，以及在骨形态发生蛋白4（BMP4）和血管内皮生长因子（VEGF）的作用下进一步分化为生血内皮，随后移除VEGF促进内皮向造血转化（EHT），最后收集血细胞冻存。

从4个iPSC 细胞系分化获得的200 万个复苏后的 CD34+HSC植入免疫缺陷小鼠中，结果显示25-50% 的小鼠实现了多谱系造血移植。该研究为进一步解析iPSC分化HSC的机制以及最终实现临床应用奠定了基础。

iPSC-HSC诱导分化流程

首先将iPSC解离成单个细胞，并接种到培养皿中，将培养皿置于摇床上形成拟胚体（EB）（图 1a、b）——中胚层诱导分化24小时——诱导HOXA基因特定的表达模式2天，在第3-7天分化为生血内皮，开始内皮向造血转化（EHT），EHT过程中细胞形态逐渐收缩凸起（图1c）——第11天开始血细胞从EB表面脱落，释放到培养液中——第14天培养液中主要是血细胞悬液，大部分细胞表达CD34、CD90、CD44、Kit（图 1d）——第14-16天收集造血细胞并冻存（图 1d）。

图1

iPSC诱导分化为HSC视黄酸前体至关重要

实验在筛选了CHIR、Activin A、骨形态发生蛋白4（BMP4）和视黄酸前体各种组合的诱导分化方案，以确定哪种组合能够产生HSC。然后将获得的iPSC衍生HSC冻存后注射到免疫缺陷小鼠的尾静脉中，以模拟临床HSC移植治疗流程。

共134只小鼠（队列1）接受了不同诱导方案分化的细胞移植，其中12只小鼠实现了MLE，重建了红系、髓系、淋巴系细胞。研究发现，大多数实现MLE的小鼠注射的细胞是在第0天使用4 µM CHIR诱导iPSC向中胚层分化，随后在第3-5天添加视黄酸前体（（视黄醇（ROL）或视黄醇乙酸酯（RETA））处理。

iHSC与人AGM（主动脉-性腺-中肾区）区HSC转录特征相似

研究人员通过单细胞测序（scRNA-seq）对iPSC衍生细胞进行研究，将iPSC衍生细胞和人AGM区细胞转录组比较分析。近期在人AGM区鉴定的HSC标志基因（RUNX1、MECOM、MLLT3、HLF、HOXA9和SPINK2）在iPSC衍生细胞中也表达（图2）。在两种中胚层诱导条件（4CH 3B5A和4CH 30A）下，RM TOM和PB1.1 BFP iPSC衍生细胞表达HSC标志基因的细胞比例及表达水平非常相近。

图2

此外，研究发现视黄酸前体的添加对HSC基因表达的影响很小，但显著影响了与视黄酸代谢相关的基因（如CYP26B1、DHRS3、CRABP2、RARB、RARG）、Wnt和成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路的调节因子（如SHISA3、DKK1、RSPO1和WNT4）、以及与血管和造血发育相关的基因（如FOXC2和CD38）。许多视黄酸基因只有在视黄醇至少持续存在11天时才能被诱导表达。

iPSC诱导分化为HSC与视黄酸前体的处理时间有关

ACTINN分析发现，RETA处理时间的延长与CS14–15 AGM造血干祖细胞（HSPC）的比例增加有关。在第二系列小鼠移植实验中，通过改变视黄酸前体处理时间来探索这一结果。共103只小鼠（队列2）注射了不同时间长度RETA处理的RM TOM iPSC衍生造血细胞。

RETA3-5天处理的细胞移植的小鼠中， 6/25（24%）实现了MLE，接受3-13天处理的小鼠中，7/19（36.8%）实现了MLE，这一差异无统计学意义；接受3-7天或3-9天处理的小鼠中没有观察到MLE；接受3-15天处理的小鼠中，1/8（12.5%）实现了MLE（图3）。虽然这表明造血过程中的视黄酸信号传导受到严格的时间调控，但基于实验动物数量有限，对这些结果的解读需持谨慎态度。

图3

随后使用第2个iPSC 细胞系 PB1.1 BFP 进行了类似的系列实验，共有79 只小鼠（队列 3）接受了细胞移植，44.3%小鼠中观察到谱系分化受限，多分化为髓系细胞，有1只小鼠在移植在19 周后表现出 MLE。这些数据表明，实验分化方案能够使第2种 iPSC细胞系产生 MLE 细胞，但成功率较低，实验方案需要进一步优化。

调节VGEF信号传导可增强iPSC诱导分化为HSC

进一步优化诱导分化方案，最近使用小鼠胚胎干细胞分化的研究表明，VEGF通过阻断Runx1表达上调来抑制内皮细胞向造血祖细胞的转化，Runx1是血源性内皮细胞的一个关键标记物，也是哺乳动物胚胎中HSC发育的调节因子。研究人员从分化的第3-7天改变VEGF浓度，以及在后期继续使用或移除VEGF，以探索能有效促进内皮细胞向造血细胞转化的方法。

结果证明VEGF呈剂量依赖性地增加了CD34+CXCR4+动脉内皮细胞的生成，在分化第 7 天移除VEGF后动脉标志物 CXCR4 迅速丢失。基因表达分析揭示了从第3天开始使用高浓度VEGF，然后在分化第7天移除VEGF（图4，PROTOCOL 3），增加了主动脉内皮细胞功能相关基因（AGTR2、IL33和EDN1）的表达，降低了ALDH1A2表达并增加了ALDH1A1表达，加速了内皮细胞向造血细胞转化。

图4

根据优化后的诱导分化方案，进行了进一步小鼠移植实验探索。接受RM TOM iPSC衍生细胞的移植小鼠（队列4）48.4%（30/62）发现了MLE（图5a-d），与早期实验（队列1和队列2）相比，实现MLE的小鼠数量有所提高，另外3个iPSC细胞系衍生细胞移植实验中也观察到了类似的结果（（PB1.1 BFP（队列5）47.8%（11/23）；PB5.1（队列6）26.7%（4/15）；PB10.5（队列7） 37.5%（3/8）），结果表明优化后的诱导分化方案更加稳定高效，并且适用于更广泛的iPSC细胞系。

图5

紧接着分析了上述接受优化诱导分化方案实现MLE的48只小鼠骨髓、脾脏、胸腺和外周血中人源细胞的分布情况。移植后12周，38/46只在外周血中检测到了人源细胞（图5e-h）；移植后16周，28/35只在四个谱系中检测到人源细胞数量增加；在骨髓中存在明显的性别差异，尤其是RM TOM iPSC来源造血细胞，雌性小鼠中人源细胞水平显著高于雄性，这与已发表的文献一致。

iPSC/CB来源造血细胞实现MLE与移植细胞数呈正相关

共39只小鼠接受了4个不同脐血（CB）来源的5×10^4-2.5×10^6单核细胞移植（包含0.7-2.7%的CD34+细胞，即移植了3.5×10^2-2.7×10^4 CD34+细胞）。在大多数注射>6.0×10^3 CD34+细胞的小鼠（14/15）中观察到了MLE（图6）。与iHSC移植情况相似，CB-HSC在雌性小鼠中显示出更高水平的植入。根据极限稀释法，新扩增的具有MLE能力的造血细胞大概每6.3×10^3 CD34+细胞中可以产生1个,与文献中的报道一致。注射<6.0×10^3 CB CD34+细胞的小鼠在骨髓中显示出较低水平的人源细胞，以及髓系或髓系和淋巴系细胞的谱系分化受限，CD34+细胞移植数量与小鼠实现MLE呈正相关性，在iHSC移植中也观察到类似的结果。

图6

实验表明无论是CB还是iPSC来源的造血细胞，相较于谱系分化受限的干细胞如仅能分化为髓系细胞或者淋巴系细胞，具有MLE能力的干细胞较少。

iHSC与CB-HSC 二级受体植入潜力相近

实验比较了接受iHSC和CB-HSC移植原代小鼠骨髓细胞的移植潜能。研究发现，12只接受iHSC注射的小鼠中，有6只骨髓细胞成功植入了二级受体中；5只接受CB-HSC注射的小鼠，有2只骨髓细胞也实现了二级受体植入。大多数情况下，二级受体植入的细胞谱系分化水平较低，主要局限于髓系细胞，有一只接受iHSC注射小鼠细胞移植的二级受体，在骨髓、脾脏和胸腺中都显示出了B细胞、T细胞以及髓系细胞的存在。该实验证实了iHSC在二级受体中的植入潜力与CB-HSC相近。

该研究通过一个明确的体外培养体系，将人iPSC分化为与人胚胎早期HSC相近的造血细胞即——iHSC。将iHSC通过尾静脉注射到免疫缺陷小鼠体内，可以产生与人CB-HSC移植后相似的长期多谱系造血细胞。且iHSC可以在移植前冻存，这与临床上移植前供体HSC冻存过程相似。因此，该方法有望为未来iHSC临床应用及血液病体外疾病模型提供新希望。

参考文献：Nat Biotechnol. 2024 Sep 2. doi: 10.1038/s41587-024-02360-7.

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