摘要:

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，其中三阴性乳腺癌（TNBC）由于缺乏有效的治疗靶点而具有较高的复发率和死亡率。化学蛋白质组学作为一种新兴的技术手段，在精准医疗领域展现出巨大的潜力。本文介绍了化学蛋白质组学在乳腺癌治疗中的两项研究成果，一项是利用天然产物Nimbolide及其与活性基团标记蛋白质组学（ABPP）技术相结合的方法实现对三阴性乳腺癌（TNBC）关键蛋白RNF114的选择性降解，另一项是基于pepstatin的天冬氨酸蛋白酶光亲和探针开发，以组织蛋白酶D（CTSD）为主要靶点，探索其在乳腺癌中的作用机制。

实验流程:

Nimbolide与RNF114的选择性降解研究

1. 效应验证: 使用MTT法测定nimbolide对231MFP和HCC38细胞系增殖的影响。

2. 靶标鉴定: 利用isoTOP-ABPP技术筛选nimbolide处理前后乳腺癌细胞中活性变化的蛋白质。

3. RNF114敲低实验: 采用siRNA技术敲低RNF114表达，观察对nimbolide敏感性的影响。

4. 相互作用表征: 设计并合成烷炔功能化探针，验证nimbolide与RNF114之间的相互作用。

5. 复合小分子开发: 利用nimbolide招募RNF114，与JQ1形成复合分子XH2，实现对BRD4的选择性降解。

CTSD的光亲和探针研究

1. 探针合成: 以pepstatin为基础，固相合成含有双吖吡啶的光亲和探针。

2. 反应性测试: 在多种酶系统中测试探针的标记能力和特异性。

3. 细胞标记: 用探针标记MCF-7等乳腺癌细胞裂解液，评估CTSD的标记效率。

4. 靶标鉴定: 利用LC-MS/MS技术鉴定标记的蛋白质，确定主要靶标CTSD。

5. 潜在互作蛋白筛选: 结合深度学习算法筛选出与CTSD可能互作的蛋白质。

文献解析:

【案例一: Nimbolide与RNF114的选择性降解】

文献名称：Harnessing the anti-cancer natural product nimbolide for targeted protein degradation.

发表期刊：Nature Chemical Biology

参考文献：Spradlin JN, Hu X, Ward CC, Brittain SM, Jones MD, Ou L, To M, Proudfoot A, Ornelas E, Woldegiorgis M, Olzmann JA, Bussiere DE, Thomas JR, Tallarico JA, McKenna JM, Schirle M, Maimone TJ, Nomura DK. Harnessing the anti-cancer natural product nimbolide for targeted protein degradation. Nat Chem Biol. 2019 Jul;15(7):747-755. doi: 10.1038/s41589-019-0304-8. Epub 2019 Jun 17. PMID: 31209351; PMCID: PMC6592714.

IF因子：12.9

实验方法：

利用isoTOP-ABPP的靶点发现：研究人员首先评估了Nimbolide对三阴性乳腺癌细胞系的影响，结果表明，Nimbolide能够显著抑制这些细胞的增殖和在无血清条件下的生存能力，并诱导细胞凋亡。为了揭示Nimbolide在乳腺癌进展中的具体机制，作者先用DMSO或Nimbolide（10μM，原位1.5小时）处理231MFP乳腺癌细胞，然后收获细胞并用IA-炔烃（100μM，1小时）原位标记蛋白质组，然后使用isoTOP-ABPP的方法，鉴定Nimbolide在乳腺癌细胞中的特异性蛋白质靶标。研究发现，E3泛素连接酶RNF114是主要靶标，并且在与Nimbolide结合后，其同位素比率显著增加。

231MFP 乳腺癌细胞蛋白质组中 nimbolide 的 isoTOP-ABPP 分析显示 RNF114 是靶标

结合验证：为了进一步确认RNF114是nimbolide的关键靶点，研究人员利用siRNA技术敲低了RNF114的表达。结果显示，敲低RNF114后，细胞表现出类似于nimbolide处理的抗增殖效应，同时对nimbolide的敏感性降低，这表明RNF114参与了nimbolide的抗肿瘤活性。为了直接验证nimbolide对RNF114的靶向作用，研究人员设计并合成了源自nimbolide的烷炔功能化探针，并在纯化的RNF114蛋白上进行验证，结果表明nimbolide中的环酮仅选择性地作用于RNF114的第8号位Cys。

Nimbolide与RNF114的C8位置发生共价反应

开发靶向复合小分子：基于上述实验结果，我们认为nimbolide能够靶向RNF114的底物识别域。因此，可以利用nimbolide招募E3泛素连接酶RNF114，并与其他小分子形成复合物，实现对其他蛋白的蛋白酶体依赖性靶向降解。为验证这一策略的有效性，我们合成了nimbolide与JQ1的复合分子XH2，并发现XH2确实能够通过蛋白酶体和RNF114选择性降解BET家族的BRD4蛋白，证明了这一策略的可行性。

Nimbolide 可用于募集 RNF114 以靶向降解 BRD4 的蛋白质

结论: 总的来说，这项研究成功展示了如何巧妙地应用Nimbolide及其与ABPP技术相结合的方法，实现对三阴性乳腺癌关键蛋白RNF114的选择性降解。同时，作者还开发了nimbolide与其他小分子形成的复合物，利用这些复合物招募RNF114，从而实现对其他目标蛋白的靶向降解。

【案例二: CTSD的光亲和探针开发】

文献名称：Pepstatin-Based Probes for Photoaffinity Labeling of Aspartic Proteases and Application to Target Identification

发表期刊：ACS Chmical Biology

参考文献：Chen S, Liang C, Li H, Yu W, Prothiwa M, Kopczynski D, Loroch S, Fransen M, Verhelst SHL. Pepstatin-Based Probes for Photoaffinity Labeling of Aspartic Proteases and Application to Target Identification. ACS Chem Biol. 2023 Apr 21;18(4):686-692. doi: 10.1021/acschembio.2c00946. Epub 2023 Mar 15. PMID: 36920024.

IF因子：3.5

实验方法：

CTSD的光亲和探针开发和标记能力：天冬氨酸蛋白酶在生理和病理过程中起着重要作用，例如组织蛋白酶D（CTSD）与乳腺癌预后不良相关。本文作者基于天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin，开发了CTSD的光亲和探针。通过在Pepstatin上引入小的光交联基团双吖啶并合成了四种探针（Probes 4-7），其中C端引入了Click反应的azide-tag。测试结果表明，这些探针在猪胃蛋白酶和牛凝乳酶中显示出浓度依赖性响应，标记能力受限于双吖啶的位置和靶蛋白种类，检测限可低至10-50 ng胃蛋白酶和50-100 ng凝乳酶。同时，在MCF-7、HT-29和HeLa细胞裂解液中，Probes 4和7对CTSD的标记最强，MCF-7细胞标记最显著，当探针浓度降至1-2 μM时，CTSD标记已达到饱和。此外，Pepstatin A（CTSD抑制剂）的梯度竞争实验证明了探针与Pepstatin结合位点相同。

Pepstatin探针4−7a的固相合成及标记能力

基于ABPP方法的靶点发现：作者对Probe 4标记的MCF-7裂解液中的蛋白进行了富集、酶解和LC-MS/MS检测，以鉴定潜在靶标。实验分为三组：1组为DMSO对照；2组为Probe 4与Pepstatin A竞争；3组为Probe 4。与对照组1和2相比，组3中只有CTSD被富集，并且CTSD的PSMs（肽段匹配数量）最高，因此推测CTSD是AfBP的主要靶标。除了CTSD外，组3还识别出其他10种蛋白，这表明CTSD可能与这些蛋白有相互作用（PPIs），但由于这些相互作用较弱，重复实验中未能检测到。作者通过放宽筛选条件和深度学习算法筛选出6个潜在蛋白，并重点关注sequestosome-1 (SQSTM1)，发现其可能是CTSD的底物，因为SQSTM1在CTSD存在下会被消化，而这一过程可被Pepstatin A抑制。