一文了解单细胞CRISPR测序及应用

自从CRISPR文库筛选技术出现以后，以高通量的方式建立基因与表型的确定关系，成为大规模的基因筛选的最佳方案。传统的CRISPR 筛选技术，根据研究目的，合成靶向不同基因的sgRNA（single guide RNA, sgRNA），以慢病毒作为载体，将基因编辑系统转导至筛选细胞中，获得不同编辑事件的细胞混合库。经筛选培养后再根据特定表型将细胞富集。扩增富集细胞中的sgRNA序列，便能筛选出与该表型相关的基因。传统的CRISPR筛选技术已在高通量筛选目的基因和寻找药物靶点等方面广泛应用。

然而，传统的CRISPR筛选仅仅知道筛选得到的候选基因与该表型相关，却无法得知该基因的调控网络。当想筛选产生表型的目的基因，且还想知道每个目的基因对其他信号通路的影响，单细胞CRISPR筛选是一个很好的解决方案。单细胞CRISPR将单细胞转录组测序与CRISPR干扰文库结合，用sgRNAs库转导细胞获得细胞库，再进行单细胞转录组测序，将细胞表型和扰动基因关联起来。CRISPR与单细胞分辨率的测序技术相结合，可以实现海量生物信息的基因筛查；带来探索基因功能和遗传调控网络的新方法；可以用于探索哺乳动物的基因功能和遗传调控网络，有助于探索大规模筛选基因调控和复杂的生物机制。

CRISPR 文库筛选技术具有高通量、精确筛选靶基因等特点，大大简化实验流程和节省时间成本。结合单细胞测序后，在单细胞高分辨率的基础上，直接建立sgRNA与其他基因表达谱和表型之间的关系，使研究结果更加精确和全面。随着技术的不断迭代更新，CRISPR 文库筛选结合单细胞测序的手段，必将对生命基础研究的探索和人类疾病治疗等方面作出巨大贡献。

应用案例1：单细胞CRISPR鉴定了新冠病毒侵染人体所需的宿主因子

英文标题：Identification of Required Host Factors for SARS-CoV-2 Infection in Human Cells

发表期刊：Cell

2020年10月24日，美国纽约基因组中心，纽约大学，哥伦比亚大学的联合团队鉴定了新冠病毒侵染人体所需的宿主因子。为筛选新冠病毒潜在的治疗靶标，研究团队对于人肺上皮细胞进行了全基因组的CRISPR筛选，并确定了新冠病毒感染所需的基因和信号通路，为进一步理解和治疗新冠肺炎奠定了基础。

该研究通过人类肺细胞中的全基因组功能缺失筛选，鉴定出了SARS-CoV-2病毒感染所需的宿主基因。构建单细胞CRISPR SCREEN KO文库，选择并验证了筛选出的排名前200个基因中的30个基因（如ACE2等），确定了新冠病毒感染所需的基因和通路，包括液泡ATPase质子泵，Retromer和Commander复合物。发现宿主因子相关的显著差异表达变化与脂质和胆固醇途径有关。宿主因子缺失可能通过胆固醇生物合成的诱导通路对抗病毒介导的胆固醇抑制作用。

应用案例2 ：利用单细胞CRISPR筛选，在体内绘制肿瘤T细胞命运调控网络

英文标题：Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer

发表期刊：Nature

2023年11月16日，美国圣裘德儿童研究医院迟洪波团队使用单细胞CRIPSR筛选，在体内绘制了肿瘤T细胞命运调控网络。揭示了促使耗竭T细胞前体/祖细胞（Tpex）细胞退出静息状态以及增强终末耗竭T细胞（Tex）细胞增殖状态的关键调控转录因子，并用以改善肿瘤免疫疗法。

利用单细胞CRIPSR筛选系统性绘制了CTLs基因调控网络并发现了其分化的检查点及关键的转录调控因子（IKAROS–TCF-1、ETS1–BATF和RBPJ–IRF1）。首先发现Tpex细胞退出静息状态并连续分化为中间型Tex1细胞，这一过程由IKAROS和ETS1差异调控。IKAROS促进Tpex1（有较弱增殖能力的一群Tpex细胞）的代谢激活及其分化为Tpex2细胞（有较强增殖能力的一群Tpex细胞）。

敲除IKAROS抑制了CTLs的功能，增加了肿瘤内CTLs的干细胞性的同时降低了细胞代谢以及mTORC1信号通路的活性，暗示IKAROS缺陷可能使细胞滞留在过度静止的状态。敲除IKAROS导致的CTL细胞积累无法单独或响应ICB改善抗肿瘤免疫反应。相反，敲除ETS1通过增强mTORC1信号通路活性和代谢重编程来调控Tpex2到Tex1分化过程，并且在多个肿瘤模型中增强了ACT和ICB抗肿瘤效果，并且ETS1基因表达量与癌症患者对ICB的响应呈负相关。揭示了TCF-1和BATF可以分别被IKAROS和ETS1负向调控，是IKAROS和ETS1在CTL细胞中的靶点。

应用案例3: 体内单细胞CRISPR筛选解码TNF信号

英文标题：In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution

发表期刊：Nature

2024年7月17日，瑞士苏黎世大学Peter F. Renz研究团队系统地研究了150种最常见的鳞状细胞癌基因在整个组织中的克隆动态。通过这一策略，研究发现了一个依赖于TNF受体1（TNFR1）并涉及巨噬细胞的TNF信号模块，该模块在表皮组织中是克隆扩增的常见驱动因素。然而，在肿瘤发生过程中，TNF信号模块被下调。相反，研究发现了一种侵袭性癌细胞的亚群，这些细胞切换到一个与EMT相关的自分泌TNF基因程序（autocrine TNF gene programme）。研究提供了体内证据表明，自分泌TNF基因程序足以介导侵袭性特性，并且TNF特征与鳞状细胞癌患者的较短总体生存期相关。总的来说，这项研究展示了应用体内单细胞CRISPR筛选技术研究哺乳动物组织的强大力量，揭示了肿瘤进化中不同的TNF程序，并强调了理解表皮中克隆扩增与肿瘤发生之间关系的重要性。研究结果不仅为癌症的发生和发展提供了新的见解，还为未来开发针对TNF信号通路的治疗策略提供了理论基础。

研究团队选取了150种最常见的鳞状细胞癌基因，使用体内单细胞CRISPR筛选策略来研究这些基因在表皮组织中的克隆扩增动态。具体方法包括：

构建CRISPR库：选取了150种最常见的鳞状细胞癌基因，包括134种突变基因和16种拷贝数变异（CNVs），其中15种是扩增的CNVs。

超声引导的子宫内病毒微注射：将携带CRISPR库的慢病毒注射到E9.5小鼠胚胎的羊膜腔内，以感染表达Cas9的表皮前体细胞。感染后的细胞会携带特定的sgRNA，用于引导Cas9进行基因编辑。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）：在小鼠出生后的第4天（P4）和第60天（P60）分别收集表皮组织，对mCherry阳性的感染细胞进行单细胞RNA测序，以评估基因表达谱并捕获sgRNA。

通过过滤和sgRNA注释，获得了120,077个P4单细胞和183,084个P60单细胞，平均每个时间点覆盖240个P4细胞和366个P60细胞。研究团队识别出了在P4和P60小鼠皮肤中的9-10种不同的sgRNA含有细胞类型，包括表皮干细胞（Epidermal stem cells）、上基底细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、T细胞和巨噬细胞。

参考文献

Shi H, Doench JG, Chi H. CRISPR screens for functional interrogation of immunity. Nat Rev Immunol. 2023 Jun;23(6):363-380. PMID: 36481809.

Daniloski Z, et al. Identification of Required Host Factors for SARS-CoV-2 Infection in Human Cells. Cell. 2021 Jan 7;184(1):92-105.e16. PMID: 33147445.

Zhou P, et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 2023 Dec;624(7990):154-163. PMID: 37968405.

Renz PF, et al. In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution. Nature. 2024 Jul 17. PMID: 39020166.