ICH遗传毒性标准试验组合的最新要求--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍（一）

审评二部黄芳华

从2006年9月开始， ICH提出对遗传毒性指导原则进行修订改版，ICH专家组对遗传毒性试验一系列问题进行了讨论修订，并起草了S2（R1）：Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）。该指导原则于2008年3月6日达到ICH进程的第二阶段。根据协调进程，该指导原则由ICH委员会向ICH三方的管理部门（欧盟、日本和美国）以征询国内外的意见。该指导原则将替代ICH原来的遗传毒性研究的两个指导原则（S2A和S2B），这将对药物遗传毒性研究产生重大的影响。及时了解国际遗传毒性技术要求的进展，对于国内遗传毒性的研究也有重大意义。该指导原则对遗传毒性试验标准组合、体内外试验的要求及结果分析和评价方面提出了新的要求。
以下是ICHS2（R1）关于遗传毒性标准试验组合的要求。
一、基本原理
药品注册要求对其潜在性遗传毒性进行全面评价。大量回顾研究表明许多被细菌回复突变（Ames）试验检出是致突变剂的化合物是啮齿类动物致癌剂。加上体外哺乳动物细胞试验可提高灵敏度和加宽遗传学物质的检测谱，但是同时也降低了预测的特异性，即提高了阳性结果发生率（而该结果与此啮齿类动物致癌性不相关）。然而，组合方法仍是合理的，因为没有任何一个单一试验能检测所有与肿瘤发生相关的遗传毒性机制。
标准试验组合应具备的基本特征如下：
i.用细菌回复突变试验评价致突变性。该试验能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的遗传毒性致癌剂。
ii.遗传毒性还应采用与哺乳动物细胞体外和/或体内试验进行评价。
一些体外哺乳动物细胞系统已广泛应用，并经过充分的验证：体外中期相染色体畸变试验、体外微核试验（注释1）、小鼠淋巴瘤L5178Y cell tk基因突变试验。这三个试验通常被认为同样适当的，因此当与检测药物的其他遗传毒性试验组合试验一起使用时（如果使用本指导原则推荐的试验方案），这些试验可互换。
体内遗传损伤试验通常是标准试验组合的一部分，其可提供影响化合物遗传毒性活性的其他相关因素（吸收、分布、代谢、排泄），并可检出其他的一些遗传毒性药物（注释2）。体内啮齿类动物细胞染色体损伤试验可大部分满足该要求，无论是应用血或骨髓的红细胞来分析微核，或者是应用骨髓细胞来分析中期相染色体畸变（注释3）。来源于给药动物的淋巴细胞培养也可应用于细胞学分析，虽然这样的分析试验未广泛应用。
在中期相细胞上的检测染色体畸变的体外和体外试验也可检测多种类型的染色体完整性的改变。染色单体或染色体的破坏可导致微核形成（如果无中心片段形成）；因此，无论是检测染色体畸变或微核的试验均可用于检测染色体断裂剂。微核也可产生于在中期相的一个或更多个染色体迟滞，因此微核试验也具有检测非整倍体诱导剂的能力。小鼠淋巴瘤细胞检测源自基因突变和染色体完整性改变两方面所致的tk基因突变。也有些证据表明小鼠淋巴瘤试验也可检测染色体丢失。
其他一些体内试验可用于标准组合，或作为追加试验以提高评价体外或体内试验结果的证据的份量（见下）。在合适的体内试验（通常是两个）的阴性结果，其检测终点被认为是足够合理和证实有暴露（见4.8节），足以证明缺乏遗传毒性作用。
二、标准试验组合的两种选择
以下标准试验组合的两种选择被认为是同等适合的：
选择一
（1）一项细菌基因突变试验；
（2）一项染色体损伤的细胞遗传学试验（体外中期相染色体畸变试验或体外微核试验），或一项体外小鼠淋巴瘤tk基因突变试验；
（3）一项体内遗传毒性试验，通常为采用啮齿类造血细胞进行的染色体损伤试验，无论对于微核还是中期相的染色体异常。
选择二
（1）一项体外细菌基因突变试验；
（2）用两种组织进行的遗传毒性体内评估试验，通常是一项啮齿类造血细胞的微核试验及第二项体内试验。
在两种标准试验组合选择中，当剂量足够时，体内遗传毒性试验常结合在重复给药毒性试验中（见4.7节）。在选择2中，如果剂量/暴露不合适，应进行一项急性的体内研究（当可能时将两个遗传毒性试验合并在一个研究中）以优化基于暴露/毒性的剂量选择（见4.7.2和4.7.3节），或者选择1中应接着进行一项体外哺乳动物细胞试验。
对于试验结果为阴性的化合物，根据当前建议实施和评价，完成了任一试验组合通常可提供缺乏遗传毒性作用的充足证明和不再需要进行其他的试验。标准试验组合结果为阳性的化合物，根据他们的治疗用途，可能需进行更多的试验（见第5节）。
标准试验组合不包括为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，从体外哺乳动物细胞试验和微核试验中可得到数目方面改变的信息，标准方案中能提供这些信息的因素是有丝分裂指数升高、多倍体产生和微核增加。也有实验证据表明小鼠淋巴瘤tk试验中可检测到纺锤体损害。在选择2中体内遗传毒性试验首选微核试验，而不是染色体畸变试验，因其具有更强的检测染色体丢失（可能导致非整倍体）的能力。
一些体内试验（注释4）可用于在选择2中体内试验评价的第二部分（见4.3节）。由于有暴露和代谢能力，肝脏是首选的组织，但是体内组织的选择和试验应基于多因素，诸如潜在代谢、体内代谢、被认为是相关组织的暴露等信息。当剂量被认为是合理时（见4.7）和方案可一致时，体内遗传毒性试验可以结合在已有的（重复给药）毒性试验中。
建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验不合适。其他试验可用作进一步研究标准试验组合得到的遗传毒性试验结果（见4.3节和5节）。若需要或被充分验证有效时，替代的种属（包括非啮齿类）也可应用。
在极端的情况下，标准组合中的一个或更多试验可能由于技术原因而无法实施，在给出的标准组合试合不适合时，替代的确证试验可用作代替，为支持论点提供充分的科学的证明。
三、标准组合的调整
以下几节列出了标准试验组合需要调整的情况。
1、预期有遗传毒性的经典类型的化合物
对预期有遗传毒性的经典类型的化合物，如一些对苯二酚类抗生素、一些核苷类似物，标准组合可调整，以在已知对这些有反应的试验/方案中进行适当的证明（也参见注释8）。
2、对细菌有毒性的受试物
当化合物（如某些抗生素）对细胞有高毒性时，细菌回复突变（Ames）试验仍应进行，因在致突变性可发生于更低的、较小毒性的浓度。在这种情况下，应进行任何一个体外哺乳动物细胞试验，即应采用选择1。
3、具有遗传毒性可疑结构的化合物
标准试验组合通常可检出有可疑结构的化合物（注释5），因为大部分“可疑结构”被定义与细菌诱变性有关。已知少数化学类别在哺乳动物细胞染色体损伤试验中比在细菌突变试验中更易检测到。因此，具有可疑结构的化合物在任一种试验组合结果为阴性时，通常已足以证明缺乏遗传毒性。但是，对于具有某些特定可疑结构的化合物，调整标准组合方案是合适的（注释5）。附加试验的选择或方案的调整取决于这些结构可疑化合物的化学性质、已知反应性和任何代谢资料。
4、使用体内试验的局限性
对有些化合物，众多体内试验（尤其是骨髓、血、肝脏）不能提供足够有用的信息。这些化合物包括毒代或药代动力学研究表明其不被全身吸收、因此无法在靶组织获得者，如放射影像剂、抗酸铝合剂、一些吸入用药和一些皮肤或其他局部用药。在改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露，以及对大部分暴露组织无法获得合适的遗传毒性试验的情况下，仅根据体外试验进行评价可能是合适的。在某些情况下，在接触部位评价遗传毒性作用可能也是合理的，虽然这些试验还未被广泛应用（注释6）。
四、生殖细胞诱变剂的检测
比较研究结果表明，从质的意义上说，大多数生殖细胞诱变剂同样能在体细胞试验中检出，因此体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常提示对生殖细胞也无影响。

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