抗生素微生物检定法简介及在药品申报中应关注的一些问题

审评三部张敏蒋煜

摘要：本文结合中国药典要求，初步探讨了抗生素微生物检定法在抗生素含量测定中的应用、不同的测定方法及其特点，测定过程中的注意事项等内容。旨在提请申请人注意在对该部分进行研究时，一方面需要根据不同目的选择合适的检测方法，另一方面需要注意影响各方法测定结果的因素，重视方法学验证。
关键词：抗生素微生物检定法，方法验证。

一、概述
抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下选择性地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成份效力的方法。是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法，在各国药典中被普遍采用。多用于结构十分复杂和多组分的抗生素的含量测定。
抗生素微生物检定法根据试验方法的不同可分为：稀释法、比浊法、扩散法。
（1）稀释法将等量的试验菌菌液加入到含有不同浓度的抗生素的液体培养基中，观察液体培养基中有无细菌生长，所得的结果是一种范围而不是绝对值。主要用于MIC测定及临床药敏试验。
（2）比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的澄清的营养丰富的液体培养基中，混匀后，在一定的温度下，短期培养（约3～4小时），培养基变浑浊，其浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增加之间存在直接关系，当一定光束照射培养基时，通过测定其透过率就可知道细菌生长的情况，其吸光度与抗生素浓度关系符合比尔定律，即在一定的抗生素浓度范围内，剂量反应为一直线。因此，在剂量反应响应曲线的直线范围内，即可设计用比浊法测定抗生素含量。
（3）扩散法扩散法中又有纸片法、管碟法等，纸片法主要用于药敏试验，我国药典收载的抗生素效价测定方法主要是管碟法，也是国际通用的方法。其基本原理是利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内的扩散作用，形成一定浓度的含抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈，将已知效价的标准溶液和未知效价的供试品溶液在同样条件下进行培养，比较两者抑菌圈大小，在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度与抑菌圈直径成正比。
根据试验设计的不同，管碟法和比浊法均可分为：一剂量法（标准曲线法，一般用于制备标准曲线和测定血药浓度）、二剂量法（含量测定）、三剂量法（检品仲裁和标准品标定）
一剂量法：将标准品一组剂量对微生物的反应在对数坐标上制成直线图，相同条件下，测得供试品对微生物得反应值，在标准品的标准曲线上查出引起该反应的抗生素的相对浓度及效力。
二剂量法：用标准品、供试品各高、低两个剂量，采用量－反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对供试品产生的效力。
三剂量法：用标准品、供试品各高、中、低三个剂量，采用量－反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品溶液抑菌圈的大小，以求得供试品的效价。剂量间的比值为0.8。
二、注意事项
在设计用管碟法和比浊法测定效价时，需注意以下几个问题：
（1）试验菌的选择：以中国药典附录规定的试验菌为首选，根据需要可选择其他的试验菌，当最好与各国药典收载的试验菌一致，便于国际交流。1）以抗生素的作用机理和抗菌谱为基础，显示临床特点，对抗生素主要成分有较强的敏感性，而对所含杂质、降解物不敏感。2）试验菌为非致病菌或致病菌的无毒变株，菌落典型，特征稳定不易变异，易于培养、保存、安全无致病性。试验菌菌落形态要典型，无杂菌，要保持菌种的新鲜，要力致保持菌悬液中菌群的一致性。3）管碟法试验菌产生的抑菌圈清晰、稳定、测定误差小，不产生次级圈。比浊法以球菌和短杆菌为宜。
（2）培养基的选择。培养基的原材料非常重要，管碟法的培养基中的胨、肉膏、琼脂等，都能影响到抑菌圈的大小与清晰度，试验发现不同胨所得抑菌圈大小和清晰度是有差别的：骨栋、鱼胨、鸡胨较好，肉胨、蛋胨较差；比浊法所用培养基应澄明，颜色以尽量浅为佳，本身不得出现浑浊，灭菌后也不得发生沉淀。培养基的成分应能满足细菌快速生长的需要，一般可加入牛肉浸出粉和酵母浸出粉。如在以金黄色葡萄球菌为试验菌的试验中加入适量的牛肉浸出粉和酵母浸出粉，可使细菌生长速度过快，达到比浊法测定的要求。另外，培养基的pH值可以影响抗生素的抗菌活性，酸性抗生素（如头孢菌素类）在偏酸性培养基中抗菌活性增强，碱性抗生素（如氨基糖苷类、大环内酯类）在偏碱性条件下活性增强，两性抗生素（如四环类、多肽类）在偏酸性条件下抗菌活性增强。要按抗生素的性质不同调整培养基的pH值。一般比浊法测定用培养基的pH值在6.8～7.8之间。
（3）培养，培养温度：一般为36～38℃范围内，培养温度要准确、恒定。比浊法采用振摇培养，以增加氧的供应，促进细菌生长。培养时间：管碟法要控制培养时间，防止不适当的培养时间对抑菌圈的清晰度的影响，由于某些抗生素呈抑菌作用，在抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长培养时间后，细菌总量增加，使抗生素敏感度下降。抑菌圈边缘的菌群继续生长导致抑菌圈变小和边缘不整齐，如采用枯草芽孢杆菌作为检定菌时，培养时间过长，菌丝向圈内生长，导致边缘不整齐，但采用藤黄微球菌作为检定菌时，在规定的温度和时间培养后，可再置室温和继续培养2－3小时，可使抑菌圈清晰，这可能是抑菌圈边缘菌群继续生长，并产生色素，使抑菌圈边缘致密而显清晰。比浊法要尽量缩短培养时间，避免因静置培养过程中，细菌慢慢沉降至底部，产生梯度的微生物生长区，表面为微亲氧性，底部为厌氧性。
（4）线性关系试验：采用一剂量法。管碟法考察线性关系的原理是在设计的浓度范围内，抑菌圈的直径随抗生素浓度的增减而增减。此时，抑菌圈的直径是抗生素浓度的函数。由此，可以得出一条曲线。如果抗生素的浓度改为对数剂量，则抑菌圈直径与抗生素的对数剂量呈现直线关系，一般设计八个浓度，剂间比为0.75－0.8。
比浊法设计原理是在设计的浓度范围内，考察抗生素的浓度与所加入试验菌的培养基的吸光度的线性关系，应至少含有五个浓度的标准品溶液，以确定测定效价时，在线性范围内的高、低剂量。
在此之前应进行预试验，以确定最佳的试验条件，调整试验菌的浓度、使用量、抗生素的终浓度、培养基等。管碟法二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径要求在18～22mm之间，高、低浓度所致的抑菌圈直径最好相差2mm，否则应调整高、低浓度的剂间比；比浊法二剂量法高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸光值应在0.3—0.7范围，高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液的吸光值的差值应大于0.1。
线性关系考察的数据，应给出试验数据表、直线图、回归方程、相关系数和线性范围。
(5)专属性试验：也可称为辅料干扰试验。将处方量的辅料按主药的方法稀释成相应的高、低剂量进行试验，辅料应不影响测定结果。对于管碟法来讲，应在与进行样品检验相同的试验条件下，辅料溶液应无抑菌圈形成；对比浊法来讲，辅料应对细菌的生长无抑制作用。即加入辅料溶液管与对照管吸光度应一致。辅料的抑菌作用应在处方选择时考虑到。
（6）精密度试验。原则上分为三部分试验，1）重复性试验，2）中间精密度试验，3）重现性试验。对于已有国家标准的药品，我个人认为只作重复性试验即可。对于一个新建立的方法，则应根据药典要求进行方法学验证。
（7）准确度试验。最好采用加样回收率试验，应设计主药加入量的80％、100％、120％三个浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液，报告已知加入量的回收率，。计算9份样品的相对标准偏差（RSD%）。
(8)溶液的稳定性。
三、小结
可以看出，目前仍有较多抗生素采用素微生物检定法测定效价，不同的测定方法侧重不一样，但都受到多种因素影响。在研究过程中，申请人需要根据测定的不同目的选择合适的检测方法，并注意影响各方法测定结果的因素，重视方法学验证。
以上所述仅代表个人意见，欢迎各位同仁对该问题进行探讨。

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