细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面

审评三部李霞张哲峰

摘要：本文通过审评中发现的一些问题，结合药品检验的工作实际，对细菌内毒素进行方法学验证的重要性、必要性以及在技术审评中应关注的几个方面进行了全面阐述。
关键词：细菌内毒素、药品申报、技术审评

热原检查法和细菌内毒素检查药典附录并没有统一的给药剂量和标准限度，均在各品种项下具体规定，故是否能有效地保证临床用药的安全性，其标准限值是我们在制订质量标准时首先要关注的。
对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。
原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。通常以一次剂量为准，如注明输2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以计算后的最大剂量，即2 g/次计算。用法用量中有成人剂量、儿童剂量、重症剂量时，要体现出最大剂量。通常儿童剂量以Kg计算时大于成人剂量，所以，此时应用儿童剂量，因为儿童与重症病人更易出现问题，故应更严格。用于感染、肿瘤、心血管、中枢疾患易感的药物建议加上安全系数。复方、输液、工艺易污染者从严，大输液一般计为0.5EU/ml。
有时候，细菌内毒素限值也以国外药典为参考，甚至就直接采用国外药典的限值。这一点在实际应用的时候，必须从中国的临床用药的实际出发，不能不加区分地把同品种中国外药典规定的限值移至中国药典，总的原则是，对这一类国外药典已建立细菌内毒素检查法的品种，原则上要求将国外药典规定的限值与按公式计算出的数值进行比较，一般应以严格者为该品种的限值。
另外以热原剂量作参考的问题，现在原则上已不再考虑热原的剂量。但大容量输液细菌内毒素限值为0.5EU/ml，主要是由热原试验中以10ml/kg iv家兔剂量得出的。
细菌内毒素的限值确定后，需要关注的第二个方面就是细菌内毒素方法学研究问题。在申报资料中，无论是仿制药还是创新药，申请人一般均会提供有关物质、溶出度、含量测定等主要检测项目的方法学研究资料，而对于细菌内毒素检查，给予的关注似乎要少得多，而申报资料中提供了这方面资料的也少之又少。实际上，处方工艺的改变对检测方法所带来的影响，对有关物质、溶出度、含量测定等项目的影响绝对不会比对细菌内毒素检查法带来的影响大，因为，细菌内毒素检查法实际是一种较为特殊的检查方法，中国药典2005年版对什么时候该进行细菌内毒素的干扰试验进行了相关规定【1】：
当进行新药的细菌内毒素检查试验前，或无细菌内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
所谓干扰试验，换句话说就是方法的可行性试验。从药典对它的要求可以看出，不论是新药，还是已有国家标准的仿制药，只要须控制细菌内毒素的，有这样一项检查项的，均应在质量研究中对其方法的可行性进行验证。在以往工作中遇到的一个实例可以对其进行说明，我们曾经对硫酸头孢匹罗这个品种进行标准复核，结果发现不同厂家的硫酸头孢匹罗，几乎相同的含量、相同的工艺，对其细菌内毒素检查所产生的干扰情况却存在较大的差别，通过进一步的试验研究，结果发现造成这种结果最大的可能是由于生产过程中引入的微量杂质的不同所引起的。这个例子进一步说明了在申报资料中提供细菌内毒素方法学研究资料的必要性。
进行内毒素干扰试验时，首先要确定限值，然后采用至少两个厂家的鲎试剂进行干扰预试验，得到一最大不干扰浓度或最小稀释倍数后，即可用这一最大不干扰浓度进行正式的干扰试验。预试验一般不要以市售鲎试剂灵敏度计算所得的MVD作为起始浓度来做。注射液建议以原液来做，粉针剂建议至少往上几个浓度级来做，探索其干扰程度，如没有干扰，方法则更可靠。
在申报资料中经常会看见这种情况：就是研究者直接用灵敏度为0.06或0.03的鲎试剂进行试验，资料中既不交代是否是由于样品有干扰，不能用高于此灵敏度的鲎试剂进行试验，或者是样品没有干扰，实验者手中只有这种灵敏度的鲎试剂，审评人员根本无法根据资料情况判断样品本身是否产生了干扰？其引起干扰的浓度为多少？不产生干扰的样品的浓度又为多少？在此情况下，无法对方法的可行性作出判断。因为现在市售灵敏度最高的鲎试剂也就是0.03，而前面已经介绍了，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加，如果一个样品，原来就只能用0.03灵敏度的鲎试剂进行检测，而这时干扰程度又增加了，则进行检测时，方法已不可行，所以，如果采用稀释法，样品浓度要稀释到必须使用灵敏度为0.06甚至0.03的鲎试剂时，只能说方法的粗放度不够，耐用性不好，最好采用其它手段排除干扰，实在暂时不能排除干扰时，可还是采用经典的热原检查法。
在资料中有时也会看到这种情况，实验者先采用一种灵敏度的鲎试剂（如灵敏度为0.5EU/ml）进行预试验，只做了一个样品浓度，就是灵敏度0.5EU/ml所对应的稀释浓度，结果这一浓度有干扰，接着就采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂在其相对应的稀释浓度来进行试验，而前面几个浓度样品有没有干扰，资料中根本无从体现，这种方法也是不完善的。
资料中还有一种情况是，实验者在预试验时做到样品稀释到30倍即已不产生干扰，但正式试验时，试验者手中只有 0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂，则实验者就把样品稀释到其对应的稀释浓度如120倍进行试验，其实这时正确的做法应该是就用30倍的稀释液进行试验。现在要确定的是什么浓度不产生干扰，对于用什么灵敏度的鲎试剂是没有影响的，干扰试验与鲎试剂灵敏度无关。理论上某一浓度无干扰，则对各种灵敏度的鲎试剂都没有干扰。只不过使用的鲎试剂过于灵敏，如样品本身内毒素偏高，则容易产生阳性，故在进行研究工作时，一般使用较低灵敏度的TAL进行试验，如采用0.5EU/ml或0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂，避免由于样品本身所含内毒素所造成的干扰影响。
中国药典2005年版一部也增加了细菌内毒素检查，但中药注射剂进行内毒素检查要慎重。由于中药成分比较复杂，干扰因素也多，其中的成分由于原料及提取工艺不同，干扰因素也在变动，确定剂量时，不要单纯用M值，最好加上安全因子。对于中药注射剂来说，不光是原料、工艺对细菌内毒素检查有影响，其中所含的鞣质、多糖等都有影响，也许用热原检查可能更合适。现在又推出一种新的体外热原试验方法【2】【3】，利用免疫分析方法测定细胞因子（cytokine）以检查药品中污染的热原，这些细胞因子包含白细胞介素－1、肿瘤坏死因子¦Α、白细胞介素－6和干扰素，目前认为它们是进入体内的热原物质刺激外周血中白细胞释放的具有热原和炎症活性的“内源性热原”。这种体外热原试验方法一旦被药典收载，可能会克服中药细菌内毒素检查中出现的一些弊端。

参考文献：
1、《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E
2、Poole S,et al.Detection of pyrogen by cytokine release.Lancet,1988,(8577):130
3、 Poole S,et al.Assay of pyrogenic contamination in pharmaceuticals by cytokine release.Pharma Europa,1989,(1):17

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