长效粒细胞集落刺激因子预防化疗后感染临床研究设计的考虑

       重组人粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）已上市多年，常被用于治疗多种原因引起的中性粒细胞减少症。通过聚乙二醇化或其他生物工程方法改造G-CSF蛋白，可改进其药代动力学（PK）特征，通过延长半衰期和减慢清除速度，可以开发出给药次数少于常规制剂的长效G-CSF。但是，长效G-CSF的开发也存在一定的问题，如何在G-CSF常规制剂研究基础上，选择合适的剂量在合适的人群中应用，既能起到预防作用同时又不会引起过多的不良反应就成为了考量的重点。本文参考了欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）发布的《用造血生长因子预防骨髓抑制治疗或清髓治疗后感染的临床试验指导原则》，简要介绍了此类长效制剂预防化疗后感染临床研究设计相关的考虑要点，旨在为此类新药的研发提供参考，其中部分内容与常规制剂临床研究的考虑要点相同。
       1 背景
       1.1 中性粒细胞减少性发热风险评估
       中性粒细胞减少性发热（febrile neutropenia，FN）的定义为单次口表体温≥38.3℃或≥38.0℃持续1小时以上，同时中性粒细胞＜500/μl或中性粒细胞＜1000/μl，但预计在随后的48小时后将下降至≤500/μl。在首次化疗前，应对成人实体瘤或非髓细胞恶性肿瘤患者化疗后产生中性粒细胞减少性发热的风险从疾病、化疗方案（高剂量治疗、剂量密集治疗、标准剂量治疗）、患者危险因素、治疗目的（治愈性或姑息性）等四个方面进行评估。
       根据疾病和化疗方案类型可分为以下三类：
       A 中性粒细胞减少性发热高度风险（＞20%）：疾病及化疗方案举例如下：乳腺癌：TAC（多西紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺）、AT（阿霉素、紫杉醇/多西紫杉醇）；胃癌：TFP（多西紫杉醇、氟尿嘧啶、顺铂）；非霍奇金淋巴瘤：RICE（利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂、依托泊甙）、CHOP-14（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、波尼松）；睾丸癌：BEP（博莱霉素、依托泊甙、顺铂）、VIP（依托泊甙、异环磷酰胺、顺铂）等。
       B 中性粒细胞减少性发热中度风险（10-20%）：疾病及化疗方案举例如下：乳腺癌：AC（阿霉素、环磷酰胺）、表阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、长春花碱；结肠癌：FOLFOX（氟尿嘧啶、四氢叶酸、奥沙利铂）；食管癌：AFP（表阿霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶/卡培他滨）；非霍奇金淋巴瘤：RCHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、波尼松）；非小细胞肺癌：TP（紫杉醇/多西紫杉醇、顺铂）等。
       C 中性粒细胞减少性发热低度风险（＜10%）
       在评估患者发生中性粒细胞减少性发热的总体风险时，除了化疗方案和所治疗的特定的恶性疾病以外，还需要考虑患者自身的危险因素，如年龄>65岁、既往接受过化疗或放疗、治疗前已经存在中性粒细胞减少或存在肿瘤骨髓浸润、存在感染/开放的伤口、近期手术史、一般体力状态差、肾功能异常、肝功能异常特别是胆红素升高、HIV感染等。
       目前无论是NCCN（National Comprehensive Cancer Network，美国国立综合癌症网络）还是ASCO（American Society of Clinical Oncology，美国临床肿瘤学会）、EORTC（European Organization for Research on Treatment of Cancer，欧洲癌症治疗研究组织），都认为中性粒细胞性发热达到20%是预防性使用G-CSF的指征，在高度风险人群（>20%）中不管是出于怎样的治疗目的（治愈、延长生存、控制症状）均推荐预防性用药。
       在中度风险人群（10-20%）中，医生和患者可以讨论预防性使用G-CSF的获益风险比。当化疗是为了达到治愈目的时，推荐预防性用药，而当化疗是为了延长生存或控制症状时，就有必要进行认真分析。这时如果患者自身危险因素是主要影响因素时，则预防性用药是合理的，但如果风险主要来自于化疗方案时，则可以考虑采用其他的方式来降低中性粒细胞减少性发热的产生，如更换化疗药物或降低剂量。
       对低度风险人群（＜10%）来说，出于性价比的考虑通常不选择预防性用药，而是考虑更换化疗药物。但是当患者接受辅助治疗是以治愈为目的，且化疗引起的中性粒细胞减少性发热存在严重风险如死亡时，则可以考虑预防性给予G-CSF。
       1.2 重组人粒细胞集落刺激因子
       粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种糖蛋白，由单核巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等受到抗原刺激后诱导产生，能特异地作用于粒细胞巨噬细胞的前体细胞，促进其增殖分化，不仅能增加中性粒细胞的数目，还作用于成熟的中性粒细胞，促进其从骨髓向外周释放，增强其游走、吞噬及杀菌能力。重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）与内源性的G-CSF作用相似，目前国外已经批准上市的产品有Filgrastim、Pegfilgrastim、Sargramostim等，均可以预防化疗引起的发热性中性粒细胞减少相关的感染发生。
       Filgrastim每日剂量5μg/kg，直至最低点后中性粒细胞恢复到正常或接近正常的实验室标准值。在化疗结束后24-72小时开始应用，不推荐与化疗同一天使用。
       Pegfilgrastim是长效的聚乙二醇化的Filgrastim，每个疗程单次使用6mg，在化疗结束后24-72小时开始应用，不推荐与化疗同一天使用。已有证据支持在每三周一次的化疗中应用，II期研究显示在每两周一次的化疗中也可有效预防，目前尚无足够的证据支持在每周给药化疗方案或化疗周期少于两周时应用，在这种情况下不推荐使用。
       Sargramostim是GM-CSF，每日剂量250μg/m²，直至最低点后中性粒细胞恢复到正常或接近正常的实验室标准值。在化疗结束后24-72小时开始应用，不推荐与化疗同一天使用。
       2 人体药理学试验的设计
       2.1 目的
       人体药理学试验的目的是获得人最初暴露于新G-CSF产品后安全性和量效关系的数据。研究人群可以是健康志愿者，或者最好是未同时接受化疗的癌症患者。需要考虑的其他因素包括：试验设计（单剂量递增，多组先后用药）、测定方法（PK、PD和免疫原性）、数据分析（PK和/或PD参数、PK/PD关系）。
       2.2 受试者的选择
       一般而言，健康志愿者中的试验适合用于确定单剂量给药后的基本药代动力学数据，但如果担心新G-CSF产品有明显副作用，可能引发伦理方面的担心，则研究只能在患者中开展。比如，健康志愿者中G-CSF较高剂量的单次给药可导致白细胞过度增多（>70,000×10⁹/L），进而可能引起脾肿大和自发性破裂的危险。因此，较高剂量水平的单剂给药试验可能需要在患者中开展。此种情况下，试验可以设计为：招募符合（一线）姑息性细胞毒化疗条件的患者，在细胞毒化疗开始前进行新CSF的人体药理学试验。人体药理学研究（包括药代动力学和不良事件的记录）应当在化疗前进行。
       2.3 PK/PD数据分析
       除了确定基本的PK参数（例如AUC、C_max、T_max、C_min、T_1/2和CL）以外，还应当评价PK与PD之间的相关性，应当进行PK指标（例如AUC）与PD指标（例如中性粒细胞计数）以及与不良反应之间相关性的分析。最好从同一项研究中收集PK和PD数据，以尽量减少研究间的差异，并更好地描述PK/PD关系。还应当从人体药理学研究中收集免疫原性数据。
       完成人体药理学试验后，应当能够确定新的G-CSF可以安全使用的一个单剂量给药范围和/或在一个指定剂量下的持续用药时间。应当可以描述出预计的副作用以及对髓系和非髓系细胞（包括单核细胞、淋巴细胞、血小板和红系细胞）的影响。试验应当能够推荐几个单次给药的剂量，以用于在探索性试验中的进一步研究，即在开始细胞毒化疗后的患者中进行研究。药效学（PD）研究中，中性粒细胞绝对计数是可接受的替代标志物。 
       2.4 生物活性测定方法
       通常当新CSF进入人体药理学试验阶段时，应当有相应的生物活性测定方法进行浓度测定。但对于药代动力学研究，应当建立和使用特异性较高的检测方法（例如RIA、EIA、ELISA）。还要探索和建立良好的免疫原性的检测方法。
       3 探索性试验的设计
       3.1 目的
       探索性研究的目的用于评价接受化疗后的患者对新的G-CSF产品的剂量反应和耐受性情况。探索性试验的结果应得出用于确证性试验的给药方案建议，包括开始治疗的时间及疗程，以及是否由于化疗对骨髓抑制的强度不同，量效关系会有差异。也就是说，探索性试验应当回答剂量和/或给药方案对中性粒细胞减少的发生率、程度和持续时间有何影响的问题。
       如果评价1个以上的给药途径，应当给出首选的一个给药途径或多个给药途径，并说明理由。不同的给药途径，都需要对中性粒细胞减少终点药效学作用的等效性（或不等效）数据。
       3.2 探索性试验的设计
       研究的设计应当为双盲、随机、平行分组的量效关系试验。有关剂量/给药方法，通常应当评价的变量为：每日剂量的大小及化疗周期中的累积剂量、给药途径以及首次给药相对于化疗的最佳时机。设计应当包括至少3个剂量水平，应当与普通制剂的标准剂量进行比较，应当确定PK线性和剂量反应情况，应当将血清浓度与中性粒细胞恢复情况进行比较。
       研究应当在明确界定的患者（例如1种癌症、疾病分期相同）中进行，每个试验中仅使用1个化疗方案。如果要研究不同的化疗方案，治疗组应当在随机分组时按化疗方案分层。一定要具体说明化疗方案对骨髓抑制的强度。
       3.3 常规应当研究的终点
       探索性试验中应当测定以下研究终点：白细胞分类计数指标、培养证实的感染发生率、中性粒细胞减少性发热的发生率、血常规监测（包括血红蛋白、淋巴细胞和血小板计数）、实际累积化疗用药剂量占计划累积化疗剂量的百分比、累积CSF剂量、输血次数、CD34+细胞的动员、PK数据和免疫原性数据。
       中性粒细胞减少是最重要的PD指标，包括4级中性粒细胞减少的发生率、中性粒细胞减少的持续时间（中性粒细胞<500/μl和<100/μl的天数）、中性粒细胞减少性发热的发生率、中性粒细胞绝对计数恢复的中位时间、绝对中性粒细胞计数的最低点、从骨髓抑制或清髓治疗开始到中性粒细胞最低值出现的时间，以及中性粒细胞绝对计数最低值<500/μl和<100/μl的发生率。
       4 确证性试验的设计
       4.1 目的
       通过以下指标证明是按说明书中推荐的用法给药，从而证明新的G-CSF产品的疗效：显著降低中性粒细胞减少性发热的发生率、持续时间和/或严重程度，支持证据包括临床结果改善，如确诊感染的发生率降低、住院天数减少、静脉注射抗生素的用量减少、或生活质量改善或生存时间延长。此外，确证试验必须提供充分的数据以确保证明新的G-CSF产品按上述用途给药是安全的。
       4.2 化疗方案对骨髓抑制的强度
       对于新的G-CSF产品，必须至少证明与当前公认的标准治疗相比在标准化疗方案中具有非劣效性，而这种标准化疗的中性粒细胞减少性发热的发生率是已经确定的。
       细胞毒化疗方案可以按照其骨髓抑制强度（即中性粒细胞减少性发热的发生率）分类。可能抵消不同细胞毒化疗方案的骨髓抑制作用所需的CSF剂量，因方案的骨髓抑制强度而异。应当说明用于确定骨髓抑制强度分类的依据。试验报告应当明确指出患者在随机进入治疗组之前是否按照骨髓抑制强度分层。如果是血液系统恶性肿瘤，试验报告应当记录是使用标准的化疗还是大剂量强化化疗方案等内容。此外，使用CSF使患者对化疗敏感的情况也应当记录。应当详细记录这些化疗方案的细节。
       4.3 确证性试验的设计
       确证试验通常应为双盲、随机、对照试验，应采用当前公认的标准治疗做对照，可以接受非劣效性假设。
       病例选择标准应当包括有关既往CSF治疗、既往预防性抗生素治疗、合并疾病以及肿瘤的组织学类型的信息。分析中可以包括接受抗生素的无发热的患者，这些患者不能用于评价中性粒细胞减少性发热，但应当另外分析这些患者中重度中性粒细胞减少的持续时间和发生率。对于试验产品和对照产品，两项分析的结果应当相似，否则说明书应当准确反映试验数据所发现的结果。
       如果探索性数据不明确，可能需要对一个以上的给药治疗方案进行试验，包括根据体重的给药方案和/或固定剂量的给药方案。
       所研究的化疗方案的强度应当按上所述进行分类，并据此说明选择对照（常规制剂、长效制剂和/或二者）的依据。
       如果开展多中心研究，应当尽可能使各中心的合并治疗标准化（例如抗生素治疗策略）。应当具体说明出院标准，且所有研究中心应当持相同标准。同样，还应当具体说明开始和停止静脉用抗生素的标准，所有中心应当按相同标准执行。
       建议关键研究中在相同的患者人群中使用相同的化疗方案。
       4.4 主要疗效终点
       确证临床试验的主要终点应当充分证明CSF的疗效有临床意义，例如显著降低确诊感染的发生率，但由于它取决于所研究的患病人群以及所使用的化疗的强度，这些情况可能会影响重要的考虑因素（如样本量），因此开展临床试验存在较大难度，可以考虑能间接说明感染减少的替代终点。与第1个化疗周期相关的发热和/或重度（4级）中性粒细胞减少的发生率和持续时间可做为替代终点。
       中性粒细胞减少性发热定义为单次口表体温≥38.3℃或≥38.0℃持续1小时以上，同时中性粒细胞＜500/μl或中性粒细胞＜1000/μl，但预计在随后的48小时后将下降至≤500/μl。在实际情况中，腋温升高至38.5℃以上并持续超过1小时，同时中性粒细胞绝对计数（ANC）<0.5×10⁹/L，这样的定义也是可以接受的。
       应当提供感染伴或不伴发热的定义及白细胞/中性粒细胞计数的定义。 
       4.5 次要疗效终点
       通常应当评价以下终点，以支持确证试验终点的结论：全血（包括血红蛋白）及血小板和粒细胞计数的恢复、用于治疗血小板减少和贫血的输血次数、住院时间、住重症监护室的时间、静脉用抗生素、已用剂量占计划用化疗剂量的百分比、减量漏用或推迟化疗所占的比例、延迟化疗的天数、化疗引起的粘膜炎的发生率和/或恢复情况、总的生活质量。
       感染是最重要的次要终点，包括感染的发生率和类型。应当明确说明由中性粒细胞减少状态引起感染的标准。建议使用以下2个标准：中性粒细胞减少期间病原微生物培养阳性或临床诊断的感染；中性粒细胞减少期间有发热（定义为体温>38.5℃）。由于中性粒细胞减少患者可发生各种各样的感染，建议区分细菌性和非细菌性感染、原发感染与二重感染以及培养证实的和未经证实的感染。还应当记录有关感染部位、病原菌分布（革兰阳性、革兰阴性和最常见的病原菌）、耐药谱和治疗反应的数据。
       4.6 安全性评价
       除了收集和报告不良事件用于安全性评价以外，出于安全性考虑，每项确证试验还应尽可能的分析和报告以下终点：总生存期、对化疗方案疗效的不良影响、监测抗G-CSF抗体至少6个月。
       虽然实际数量未具体说明，但应当有足够大的安全性数据库，并应当阐述其合理性。安全性数据库取决于新药和参比药物的用药经验，以及G-CSF的一般考虑。即使观察到普通制剂没有明确的免疫介导的不良反应，但新的长效制剂不能完全除外这些反应。虽然没有给出绝对的数目，但上市前免疫原性安全性数据库应当包括至少300例患者，随访至少6个月，如果不能做到这一点，应当阐明该数据库大小的理由。
       4.7 有关适应症需考虑的要点
       适应症应当考虑所研究的患者人群、所研究的骨髓抑制的剂量强度及临床试验中得到的数据。如果要开展多项研究，这些研究的设计应当涵盖不同的疾病。
       如果在临床试验的某个阶段因研究者担心的某个问题而从方案中排除了某些疾病（例如髓系恶性肿瘤），则应当在“警告”部分列出这些疾病及排除的原因；应当给出警告的原因，即：缺乏这些患者人群中的安全性和疗效证据。
       5 小结
       重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）已上市多年，而其长效制剂由于其药代方面的特性和优势，可使给药次数明显减少，并能获得不劣于普通制剂的有效性和安全性，因此，近年来成为研发的热点。本文介绍了长效粒细胞集落刺激因子预防化疗后感染的临床研究设计的考虑要点，旨在强调研究设计在药物有效性及安全性评价中的重要性，供临床研发中参考。
       以上观点为针对研究设计时的重点内容的一般考虑，仅代表我们当前的认识，欢迎业界和研究者在制定方案过程中，及时与我们沟通和讨论，并提出意见和建议。
参考文献：
[1]EMA. Guideline on Clinical Trials with Haematopoietic Growth Factors for the Prophylaxis of Infection Following Myelosuppressive or Myeloablative Therapy.

[2]NCCN. Myeloid Growth Factors，Version 1.2014.