欧盟EMEA非临床研究中检测药物诱导性肝毒性早期信号指南（草案）（译文）

                                 审评二部   黄芳华  译

译者注：由于肝脏在机体内具有特殊的解剖位置和生理生化特性，肝最易作为外来化学物的毒作用靶器官，因此易引发肝毒性，药物诱导性肝毒性是药物毒理学评价中重点关注的一个问题。针对药物诱导性肝毒性，欧盟EMEA于2006年6月28日公布了《非临床研究中检测药物诱导性肝毒性早期信号指南（草案）》，该草案中提出了在非临床研究中检测肝毒性早期信号三步走的阶梯式方法，现翻译该指南，以期为研究者提供参考。

实施概述
    过去的十年里，肝毒性成为药物警戒性安全性报告和已上市产品撤市的最常见原因之一。本指南介绍根据临床设计、为评价非临床肝毒性表现的临床相关性，在检测肝毒性信号和进行机制研究方面的阶梯式方法（步骤I - III）。本指南的重点在于完善从标准的非临床研究中（步骤I）获得的资料的应用。此外，基于标准非临床研究中的发现，建议进行附加、机制方向的研究（步骤 II - III）。观察评价肝毒性信号的关键要素是：1）比较给药前和实验点的个体动物数据，而不是用组平均数据进行比较。2）尽管由于在非临床研究中非啮齿类动物样本数少而导致的肝毒性表现可能无显著性差异，任何在非啮齿类动物研究中观察到的肝毒性信号均应充分研究。肝毒性信号的收集不受药物开发进程的任何特殊阶段的限制，而是涵盖所有阶段的一个持续过程。本指南的原则也可应用于解决在药物警戒性安全性监测中通过回顾非临床性安全性资料和根据本指导原则而收集到的肝毒性信号。这些原则也可应用于评价文献信息。所有肝毒性信号应收集在非临床安全性总结的一个标题下。
1．前言
    过去的十年里，已上市药品撤市的最常见原因之一是肝毒性（通常认为是特异性的）。这些案例资料的重要评价已产生了这样的发现：在某些情况下上市申请时的非临床研究中可获得的资料中包含有可预测肝毒性的信号（在回顾时）。
这些信号被称之为“肝毒性早期信号”。因此，需要有一个指导原则，以指导当检测到肝毒性早期信号时该如何做，以及如何收集和应用这些非临床资料（当排除其他原因导致的肝损伤时），以利于确定肝毒性的早期信号和提高人用安全性。
2．范围
    本文件的目的是提供如何确定、收集和报告药品诱发的肝毒性的早期非临床信号，以减少临床肝脏不良反应风险的指南。本指南主要适用于新活性物质。但是，本指南中的基本原则也有助于确定已上市药品的潜在肝不良反应的机制。
3．法律基础
    本文件应与Directive 2001/83/EC (修订)和所有相关的非临床指南一起阅读。下列的指导原则尤其相关：Note for guidance on Duration of Chronic Toxicity Testing in Animals (Rodent and non Rodent Toxicity Testing)(CPMP/ICH/300/95), Note for Guidance on Repeated Dose Toxicity (CPMP/SWP/1042/99)), ICH S8 Immunotoxicity Studies for Human Pharmaceuticals, Note for Guidance on Carcinogenic potential, (CPMP/SWP/2877/00). Guideline on the non-clinical documentation for mixed marketing authorisation applications (CPMP/SWP/799/95).
4．一般考虑
    药物诱导的肝毒性反应有多种类型和原因，发作时间也多样，可从极短到持续较长潜伏期。临床上最相关的反应包括肝坏死、肝炎、胆汁瘀积、血管变化、脂肪变性和磷脂质病（phospholipidosis）。
    药物可通过多种机制产生肝毒性。例如，它可是直接作用或通过活性代谢物间接作用。药物或其代谢物在特殊的受体结合后可能导致肝毒性，或活性代谢物可与肝脏大分子反应导致直接的细胞毒性。另一方面，肝毒性可通过免疫级联反应介导。
    最后，一个具有遗传毒性的药物/药物代谢物可导致癌基因激活，进而导致肝脏肿瘤。但是，肝脏肿瘤的发生并不能认为是肝毒性的早期信号，因此不在本指南的范围内。
血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的升高，合并胆红素水平的升高，现在被认为是肝毒性最相关的信号。肉眼和特别是组织病理学的检查将确定肝毒性是否发生和提供肝脏毒性类别的进一步证据。如果肝毒性发生，应评价：
i）确定变化以及其强度，
ii）提供NOAEL（未观察到不良反应水平），
iii）确定毒性的机制/发病机理，使可对将来的临床应用提供建议。
    当可能时，毒性基因组资料对于研究肝脏毒性作用机制或对肝毒物敏感性的种属差异、和发展合适的肝毒性生物标记是很重要的。
5．方案设计
    肝毒性信号的收集不限定于药品开发的任何特定阶段，而是一个持续的过程，从非临床发现开始，持续至临床试验（I-III期）和上市后试验。人的任何持续的、未恢复的异常肝功能可能与用过的药物有关。此种发现是非临床研究资料再评价和可能的附加研究的起动器。
    在检测和评价肝毒性时主要重点是，如何最佳地应用从已有的非临床研究中获得的资料。此外，可能需要进一步的研究。因此，检测和评价肝毒性是一个逐步的过程；
i）在基础药理学和毒理学研究中确定提示肝毒性的信号；
ii）采用体外和/或体内试验确定肝毒性可能的机制；
iii）开发新的机械化的体外和/或体内的模型，以提高或更可靠地预测肝毒性。
    就标准非临床研究中所用的动物种属而言，一般认为：表现出肝毒性信号或组织病理学不良反应的动物种属越高级（啮齿类、非啮齿类、非人的灵长类），确定与肝毒性有关的机制的相关性越高。
5．1肝毒性终点
    在药物开发进程的早期阶段，任何肝毒性信号均应仔细评价。在非临床研究中，尤其是在非啮齿类动物中，肝毒性参数变化的统计学分析应同时进行组间和组内的变异性分析。由于非临床研究中非啮齿类动物样本数少，任何肝毒性信号均可能有生物学意义，尽管该变化可能无统计学意义。因此，非啮齿类动物中的任何肝毒性信号的生物学意义均应明确，而且，若可能，应考察可逆性。
5．2 步骤I：检测肝毒性影响的标准非临床试验
肝毒性应从标准的非啮齿类动物研究中确定。重要的信号获得于：
i) 临床化学，
ii)组织病理学，
iii) 生物（体内）累积
iv) 外源性（xenobiotic）代谢酶的表达，和活性代谢物的产生。
5.2.1临床化学
    不同的临床化学变化可用于获得肝毒性信息。在非临床研究中（啮齿类和非啮齿类）确定肝毒性建议的参数包括如下：
表1  被认为在确定肝毒性方面有用的临床化学变量

TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、葡萄糖（GLU）和血尿素氮（BUN）、活化部分凝血激酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）可用于肝脏合成功能的追加试验。
5.2.1.1肝细胞毒性
    在上述提及的指标中，ALT和AST的变化单独或与胆红素联合，在啮齿类和非啮类的非临床研究中评价肝细胞损伤是优先推荐的指标。ALT被认为是比AST更特异和敏感的肝细胞损伤的指标。ALT活性在2-4倍范围内的提高和比同期对照组的均值或比给药前的个体值高，应提高对潜在肝细胞损伤的关注，除非有明确的可选择性的解释存在。当想得到附加的肝脏病理指标时表1的追加参数是有用的。
5.2.1.2肝胆管毒性
    个体或组平均值数数据中，与同期对照组比较总胆红素（TBILI）或总胆汁酸（TBA）浓度提高，应仔细评价其他研究资料的内容以排除已知会影响胆红素浓度的肝外因素。在无其他肝脏参数变化或溶血时，胆红素单独的边缘（marginal）提高不太可能是肝脏不良反应。
5.2.1.3线粒体毒性
    标准的非临床研究不足以确定线粒体损伤为基础的肝毒性。但是，以下临床化学信号可有所提示：
- 血乳酸盐水平升高。
- OCT浓度升高：OCT是一种在线粒体中的鸟氨酸循环酶，具有肝特异性和在大鼠肝脏中可诱导。
- GLDH浓度提高：GLDH正常时存在肝线粒体中，但在肝功能紊乱时会释放到血浆中。
5.2.2组织病理学
    在对个体资料进行评价时，标准的组织病理学资料可与临床化学变化联合起来分析。该分析可确定肝毒性是否发生（当个体的临床化学发生变化时），并可提供肝毒性性质或原因的附加资料。
5.2.3生物（体内）累积、外源性代谢酶的表达和活性代谢物的产生
    母体药物或其代谢物在肝脏中的蓄积是担忧的潜在原因。即使在治疗剂量时，药物也可影响外源性代谢酶（诱导或抑制）和促进活性代谢物的产生。
    代谢途径的研究为活性代谢物的产生提供线索。可能有潜在肝毒性的结构类型是呋喃、醌、环氧化物、噻吩、羧酸、苯羟基（phenoxyl radicals）、苯酚、酰卤、酰基葡萄糖醛酸苷、苯胺基、芳香族和羟氨类。若形成上述结构，应进行进一步的机制研究（见步骤II）。
5．3步骤II：检测肝毒性影响的追加试验
试验策略依赖于：
·标准非临床研究中出现的信号（步骤I）
·受试物是否属于已知有肝毒性危险的药物类别。这种情况下推荐进行包括设置有从治疗类别中的阳性对照的进一步研究。
步骤II是机制方向的研究，可包括：
i) 采用体外肝脏模型的细胞毒性试验，
ii) 对潜在胆汁瘀积损伤的进一步研究，
iii) 线粒体功能和形态学试验，和
iv) 组织病理学，
v) 免疫学基础上的试验。.
5.3.1 在体外肝脏模型上的母体或代谢化合物的细胞毒性试验
    如果肝毒性信号发生在体内（步骤I），应对潜在肝毒性在体外机制试验中对母体化合物或（活性）代谢物进行筛查。
    常规的细胞毒性试验依赖于测定一个或多个细胞毒性指标，包括膜完整性的丢失和细胞溶解（如LDH释放、不可透过膜的DNA染色）、凋亡（如胱门蛋白酶的激活）、关键大分子或小分子清除剂的丢失（如ATP或谷胱甘肽（GSH））、线粒体影响（如四唑盐试验、Alamar蓝试验）或抗增殖影响（如抑制DNA或蛋白质合成）。出于这个目的，多种体外的人和动物肝脏模型是有用的，包括短期到长期的细胞或组织培养系统。推荐采用有代谢活性的肝细胞（可表达I相和II相生物转化相关酶）。但是，因某种体外肝脏模型有其特异性的限制（如缺乏肝脏特异性功能），这些应予以考虑。
    任何指示细胞毒性升高的信号应考虑其相关性和是否需进行更多的研究。
    临床上，肝毒性也依赖于遗传药理学背景和病人的临床史。与动物细胞相比人肝细胞（天生的以及后天的）具有更大的个体间差异，可用于探索特殊的基因型或表现型的肝毒性筛选。
5.3.2胆汁瘀积损伤指标
    若在步骤I中大鼠上观察到胆汁流量受抑（直接胆红素或胆酸升高）和血清ALP活性升高，伴随的5’-NT水平的升高有助于确定胆汁瘀积损伤。犬的血清ALP活性的升高可引发对ALP同工酶的分析，以排除由肾上腺皮质功能亢进相关ALP对碘氧基苯甲醚（ALP isoform）引起的误解。
    当胆汁瘀积损伤已在步骤I中确认，应进行潜在的与肝脏转运体表达的药物相互作用研究。在药物相互作用预测将来药物临床使用的情况下，相关的体外/体内非临床的药物相互作用研究应前瞻性地进行。
5.3.3线粒体毒性的指示变化（体外/体内）
    线粒体实际上是多种类型损伤刺激（包括缺氧和毒素）的重要靶点。当步骤 I 指出进行进一步的机制研究时，应考虑线粒体毒性的评价和应评价时辰变化（time frame）。下述段落对可能用于旨在评价线粒体毒性的研究中有潜力方法学进行描述。
    线粒体功能参数可包括ATP含量（细胞培养）、线粒体跨膜电位（体内、细胞培养）和乳酸盐浓度（细胞培养、体内）。如果这些参数发生变化，应进行进一步的研究（如在细胞培养中线粒体酶活性或线粒体耗氧量的测定）。
    若干药物通过耗竭线粒体DNA（mtDNA）含量而产生线粒体毒性作用。因此mtDNA定量可用作线粒体毒性的标记（细胞培养、体内）。至少应对可能有减少mtDNA潜力的药物（抑制DNA pol γ、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入性药物以及可能在线粒体内蓄积的亲脂性阳离子药物）进行那些研究。
    可能的线粒体损伤可由继发的机制诱导（如以可诱导肝细胞坏死或凋亡的活性代谢物形式），可能应进行通过考察DNA损伤、p53 和bax的过度表达、谷胱甘肽缺乏、蛋白巯基氧化和细胞溶质中的Ca2+增加而进行的分析。所有这些变化均可导致线粒体通透转运孔（MPTP）的开放和诱导凋亡。
    应考虑线粒体形态学评价和应评价时辰变化（time frame），因为线粒体的早期形态学变化提示受试物的直接作用。电镜可用于检查线粒体形态学的变化，这种变化常常伴随着细胞损伤（如肿胀、在肿胀的线粒体中表现出小的富磷脂的无定型的密度）。
    活性氧产生的提高和脂肪酸β-氧化的降低和/或Co-A的多价螯合可能用作体外微囊脂肪变性的生物标记。
5.3.4 组织病理学 
    如果在步骤I中观察到组织病理学改变的信号，特殊的组织病理学分析（如特殊的荧光技术和免疫组化）可用于确定肝毒性损伤的机制。
5.3.5免疫基础的肝损伤
肝脏的免疫特征
    肝脏扮演着极重要的、不同于其他免疫器官所扮演的免疫角色，这可归因于其独特的白血球组分的存在。肝内的淋巴细胞种群不同于淋巴器官和外周血，包含有更高比例的记忆T细胞、NK细胞、NKT细胞和有TCRδ受体的T细胞。而且，肝脏固有细胞包含巨噬细胞类枯否细胞和肝脏窦状隙内皮细胞（一种独特的非骨髓内的抗原呈递细胞类型，被认为参与免疫耐受）。
免疫基础肝损伤的可能机制
   免疫基础的肝损伤的机制常常由可与共价结合蛋白的活性代谢物的形式引起。但是，这种事件被认为不足以引发致病的免疫反应，第二个同时伴随的引发物被认为是必需的（如轻的肝损伤、炎症状态、病毒或细胞感染）。免疫基础的肝损伤也可起因于肝脏抗原的自发性免疫反应，由于对这些抗原耐受的缺失（继发于细胞损伤或与药物/药物蛋白加合物的交叉反应），或源自非抗原耐受肝细胞的旁损伤（bystander damages）。而且，为适应先前肝损伤的一般的炎症反应或对原有的或蓄积的粒细胞的非特异性激活反应可发生。炎症过程产生可影响肝损伤或修复的细胞因子。比如，活化的枯否细胞可顺次分泌炎性细胞因子如IL-1、TNF-α或NO，可诱导凋亡、促进细胞生长或引发炎症过程。
    另外，肝细胞可产生很多急性蛋白质，包括C-反应蛋白（CRP）和补体因子。
为解决肝损伤的免疫相关的非临床研究方法
免疫基础的肝损伤信号可在步骤I和步骤II的组织病理学分析（如肝实质的嗜酸粒细胞升高，轻度的肝脏炎性病变或肉芽肿）和电镜研究获得。当发现这些信号，建议在步骤III进行确定免疫系统在肝脏损害中的角色和涉及机制的附加研究。
5．4步骤III：附加试验
    若药物诱导性肝毒性在步骤I-II中被确定为一个安全性议题，确定涉及的机制和评价危险程度的附加试验可能是必需的。就这点而言，与剂量相关的肝损伤的持续时间是关键的。在非临床的再次给药试验中，肝损伤的范围与广谱的肝损伤相关的生物标记一起，可确定药物诱导性肝损伤。
    同时预期在要求方面将有相当多的变化，要求取决于如临床和非临床发现、已知的类别效应、产品预期的适应症、医学需要等多种因素。在某些情况下，新方法必须发展并确认有效。因此，在本步骤中没有强制性的要求，但有下述建议。鼓励开发和研究新的检测肝损伤的生物标记。
5.4.1免疫相关信号
    这些研究包括，例如：i）鼓励寻找免疫相关的肝脏的生物标记，如药物或代谢特异性抗体。但是，由于动物模型在预测临床敏感性方面不能得到广泛承认，人的离体淋巴细胞/单核细胞试验有可能代替非临床的免疫反应试验。ii）过敏性反应补体药物可在表现出过敏反应症状的动物血清中检测。iii）可监测炎症细胞因子水平，这些已被报道与可预测肝损伤的其他常规的临床特征相对应。炎症—或损伤—相关的免疫调节剂包括γ干扰素（INF-γ）、Fas配体和肿瘤坏死因子（TNF）。保护性的因子包括IL-10、IL-6、单核细胞化学诱导蛋白1（monocyte chemoatractant protein 1）、巨噬细胞炎症蛋白和IP-10. iv) 。应考察肝内淋巴细胞特征（细胞群、活化状态）。
5.4.2凋亡/坏死
    评价应包括超微结构病理学、形态测定和特殊组织学染色。
    线粒体能量产生、解偶联能力、线粒体通透性导的失调导致MPTP的瞬间开放，是线粒体损伤的信号。接下来，线粒体外膜的肿胀和破裂可导致细胞色素C的释放——这可活化半胱天冬酶级联和诱发凋亡——这可作为肝脏反应的机制标记。细胞色素C释放到胞质中或半胱天冬酶分解产物细胞角蛋白18（CK18）的释放是线粒体干扰的有潜力的生物标记。
    细胞损伤的类型、细胞渗透的存在、坏死和/或凋亡的存在均应评价。
5.4.3动物模型
    对某些药物（潜在的）炎症反应诱发肝损伤阈值的证据正在积累。
    例如，如果在步骤I和步骤II中观察到肝毒性，并且如果该药品拟用于类风湿性关节炎、感染性疾病、糖尿病等类的疾病，应在合适的脂多糖（LPS）诱导的炎症反应上、体内考察肝毒性影响。
    在药物诱导性肝毒性中细胞因子的潜在作用也可在基因敲除小鼠上进行研究。比如，IL-4和 IL-10 基因敲除小鼠和缺乏诱生型一氧化氮合酶小鼠表现出较之其他野生型小鼠对对乙酰氨基酚诱导的肝毒性更敏感。
5.4.4新技术
    芯片技术可用于研究与特异的药物反应潜力有关的基因表达的类型。该策略具有不要求该种机制的先前的认识、可检测很多不同的基因的优点。而且，肝毒性药物和非肝毒性相似物的转录子和蛋白组学性质可能可致使肝毒性新生物标记的发现。
6．与临床开发相关的毒理学数据处理时机
    非临床的肝相关资料随着研究进程而积累。最终的危险度评估在汇编上市申请资料阶段进行。但是，为评价药物诱导性肝毒性的危险性，所有积累的资料均应在进入各临床研究进程（I、II或III期）下一阶段前进行总结，并需在一个独立的标题下向主管当局提交。
    在肝毒性信号在批准上市后出现的情况下，申请者应立即重新回到非临床程序和开始如本文件中所描述的非临床机制研究。
7．数据表示
    所有非临床肝毒性信号应收集在非临床总结中的一个标题下。遗传毒性试验的阳性结果，尤其是采用肝细胞表达相关的外源性代谢酶时，应考虑与肝毒性的潜在性相关。