用于血源筛查的核酸检测试剂的现状及研发中应注意的几个问题

审评五部生物制品室白玉高恩明

一、NAT用于血筛的研究现状
EIA 方法因其简便、快速、成本低、适于大量样品同时检测的优点，已经广泛用于血液筛查中。尽管近十几年来的不断改进，使得EIA方法在灵敏度和特异性方面有了很大提高。但该方法应用于血液筛检后，每年仍有少数新发输血后肝炎和艾滋病病例的报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV 和HIV 的危险性分别为1∶66 000 、1∶103000 和1∶676 000。这些危险性主要来自：病毒感染窗口期献血、病毒变异、不典型的血清转换（如隐匿性感染）以及实验室的错误操作。
核酸检测(nucleic acid testing，NAT) 技术敏感性高，可检出标本中极微量的核酸，甚至在病毒感染后数天即可检出病毒核酸，大大缩短了窗口期。有研究报道：NAT可将HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分别缩短25－30d (缩短窗口期42 %－50 %)、57－59 d (72 %－89 %) 和10－11 d (50 %)；此外NAT还可以检出因上述其他3种原因而漏检的被感染献血。尽管NAT 技术从理论上并不能完全消除感染窗口期，但通常在病毒核酸转阳之前的血液传染性很低，可以有效地预防经输血传播病毒性疾病。因此，在现有科学技术条件下，NAT 技术的引入可使输血传播疾病(transfusion-transmitted viral infection，TTI)的危险性降到最低。
在发达国家，丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的核酸检测已经用于献血者窗口期样本的筛查，该措施在剔除有传染性的血液、减少TTI的发生中发挥了重要作用。在亚洲，日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIV－1 NAT 筛检的国家。在欧洲,从1997年起就已经有一些国家的生产商开始采用NAT用于血浆的筛查，1999年欧盟颁布法规要求直接检测分离血浆中的HCV RNA，随后，又增加了HIV－1 RNA。上世纪九十年代，美国工业界和NIH、FDA联合，研发HIV－1和HCV的NAT检测系统。2001，FDA批准了第一个用于原料血浆筛查的HIV－1 NAT试剂和HCV NAT试剂（由National Genetics Institute开发）。2004年FDA发布指南，要求该指南发布后6个月血液制品企业和血站进行NAT全血和血液成分HIV－1和HCV 核酸的筛查工作。
我国从2002年开始了将NAT技术用于HBsAg阴性、抗HIV阴性和抗HCV阴性的原料血浆筛查的研究工作。目前已有一些研究数据和初步的成果。但是由于我们起步较晚、TTI的流行状况与欧美国家也有所不同，在借鉴国外研究成果的同时，也应注意探索开发适合我国特点的NAT试剂以及制定相应的技术规范。
二、NAT血筛试剂研发中应关注几个技术问题
1.灵敏度
这里所说的灵敏度是指分析灵敏度和混样原始样本的灵敏度（以下简称混样灵敏度）。前者是指试剂本身的检测性能，最低检出限；后者是受检测时的混合样本数量影响的，混样数多，混样前的样本被稀释的倍数就高，就要求有较高的病毒载量才可检出。如考虑到经济学因素，在满足混样灵敏度要求的前提下，增加混合样本数，可以降低检测成本。
HIV和HCV：对于HIV和HCV的检测灵敏度，FDA已有一个明确的要求，也就是混合检测的分析敏感性（analytical sensitivity of the pool test）：100拷贝/ml，原始捐献样本（original donation）：5000IU/ml。根据目前我国NAT在血站系统和血液制品企业应用的零散报道，献血人群的HIV和HCV的检出情况与国外基本相当，故在没有国家标准的前提下，可先借鉴采用FDA的标准。
HBV：对于HBV，由于我国的流行病学现状和特点，HBsAg、抗HIV和抗HCV阴性的样本的NAT阳性检出率较HIV和HCV高，而目前国际上也没有统一的灵敏度要求。笔者认为，鉴于HBV的传播风险高于HIV和HCV，故对其NAT灵敏度的要求也应高于HIV和HCV的NAT试剂。根据日本的一项追踪研究报道，这类样本包括窗口期样本和隐匿性感染样本，并且这两类样本均可引起受血者HBV的感染。因此，在我国制定该灵敏度标准时还应根据对我国发现的这类样本病毒载量等追踪研究的结果确定。
2.核酸提取
因NAT试剂用于血源筛查，属于高风险试剂，就要求最大程度的检测出样本中的病毒核酸，这就对核酸提取效率提出了更高的要求。据报道，目前核酸检测常用的Taqman技术和TMA技术本身就锁定了该方法学的灵敏度，因此高效率的核酸提取方法就成为了各大核酸试剂公司角逐的关键技术。目前，常用的核酸提取方法有酚－氯仿法、盐析法、固相载体法等。后者目前在试验中使用的有硅胶离心柱和磁珠。相比之下,磁珠法由于操作简便、节省时间、易于自动化、对核酸样本的回收率高和纯度好等优势而倍受研究者青睐。目前市场上也已经推出了该类型产品，不过基本上为国外产品所垄断，因其价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。建议研发企业研制具有我国自主知识产权的高效、易于自动化的核酸提取方法以适应NAT试剂血筛的需求。
3.内对照
目前，我国诊断试剂生产企业生产的核酸检测试剂，多采用外对照作为PCR的质控，鲜有采用内对照的产品。随着分子生物学技术的发展和人们对核酸检测技术的认识不断深入，国外产品和现在开发的国内产品也开始采用内对照控制核酸提取和扩增过程。作为血源筛查的HIV、HCV RNA检测试剂，因其需要提取样本的RNA，并有逆转录过程，因此，应设计含有RNA的内对照（如假病毒颗粒）来监控这些过程才更加合理。
4.自动化
血站和血液制品企业每天都有大量的样本需要检测，因此对NAT的自动化要求程度就比较高。也就对开发相应的混样、核酸提取、核酸扩增、数据分析、拆分确认的自动化仪器提出了挑战。罗氏公司已经建立了自动化程度很高的HIV-1、HBV和HCV的NAT检测技术平台，避免了手工方法的耗时、繁琐、易出错误。但是对有些原料血浆样本，在低温下有冷沉淀形成，自动化取样时容易堵塞腔道，造成机器故障，也是NAT研发企业需要考虑的问题。
另外，研发企业在完成试剂的前期研究后，还要进行一个大规模的临床考核（样本量至少10万人份）来考评研究试剂的灵敏度、特异性、适用性等，以考察研发试剂在实际应用中的性能，为上市申请提供依据。

以上观点有个人的考虑，也有来自同类试剂专家咨询会议的总结和CDE内部讨论达成的共识，愿与大家交流讨论。

用于血源筛查的核酸检测试剂的现状及研发中应注意的几个问题

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