浅析不同定量方法中积分方法的玄机妙设

定量方法积分方法色谱分析

药事纵横

08/22

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👉外标法定量中的积分

外标法定量的积分的对象如果是含量测定项，一般以等度方式洗脱，浓度基本是以几十到几百μg/ml的供试品浓度作为分析物，获得的色谱图相对来说基线稳定，积分难度不高，一般积分设置中将溶剂峰禁止，峰宽和阈值，最小峰面积设置好保证不同线性水平和外标浓度水平的主成分色谱峰的积分合理（非过小或过大）就可以。但是在有关物质检查中就会出现一些比较麻烦的情况。

以API的有关物质中的杂质定量分析为例，本例中的特征是主成分色谱峰在色谱柱中表现为超载的平头峰，也是本例中积分的难点如何使主峰在积分中为单一色谱峰，同时杂质峰的积分没有过度积分或者积分较小。供试品溶液的色谱图如图1所示，杂质A和杂质B均采用外标法定量分析，本图中的积分尝试过程为：设置峰宽30，阈值1或者100，结果主峰为双峰；设置峰宽150，阈值1或者120，主峰可实现单峰，但是杂质A和杂质B表现为无法积分或者积分不当；为了使主峰为单峰积分合理，需要较大的峰宽值和阈值，但是势必造成杂质的积分不当，此时打开积分事件，可以进行细化的积分，比如在杂质出峰的时间范围内设置峰宽，将峰宽值设置较小，看看积分结果，但是本例中仍然未实现良好杂质积分；最后，选择积分事件中的强破峰，将多图重叠在一起，选择杂质出峰的合理的时间范围进行强迫峰，最后实现了主峰和杂质的同时有效的积分。作者认为在特殊环境中应用强迫峰的设置，但是需要系统的稳定，即各组分的保留时间比较一致，并且对照品溶液和供试品溶液中的杂质峰均积分合理的情况下使用。

👉峰面积归一化定量中的积分

以API的有关物质方法中的杂质测定为例，方法采用梯度洗脱的方式，在梯度变化较快或者梯度范围比较大的情况下，势必会在色谱图中的某个未出峰的时间范围内有基线的波动，而面积归一化法的定量方式需要把忽略限以上的所有杂质和主峰准确的积分，然后进行计算，倘若某个杂质积分过大或者过小，把基线当成杂质进行积分了，那么会造成计算结果的偏离。本例中的色谱图中有一段未出峰的位置存在基线波动，如图2所示，本图中的积分尝试过程为：设置峰宽50，阈值3或者30，设置缝宽150，阈值1或者50，基线波动的一段总是被积分上，但明显不是一个色谱峰，那么如何设置此时间段不积分呢，此时需要提示一个关于积分禁止的使用，如果不需要积分某一段，直接使用积分禁止是非常方便的，但是积分禁止的使用需要供试品色谱图和空白溶剂或者空白辅料完全重合才使用，像本例中的这用情况，也许是供试品中的某些基质造成的基线波动，那么在设置积分的时候可以选择积分事件中的按时间强迫基线，但是作者在多数选用的时候效果并不显著，可以选择最小峰面积，根据方法中规定是有忽略限的，那么忽略限的峰面积可以将其设置成最小峰面积，但是这种基线波动往往能达到远大于忽略限的峰面积，此时可以选择基线波动的起点时间，选择最小峰面积设置为一个足够的数值，然后在基线波动的终点时间，选择最小峰面积设置为忽略限的峰面积（比如本例中的忽略限最小峰面积为10000，那么在积分事件中可以设置6min最小峰面积200000，14min最小峰面积10000），这样就可以使基线波动的干扰避免，得到相对真实的峰面积归一化的含量。作者认为在进行这样的积分事件设置前，需要对整个方法学验证过程中的所有色谱图进行审查或者根据先验知识（之前的稳定性数据等），供试品溶液中在此时间段是否有杂质出现。

👉主成分自身对照法定量中的积分

以有关物质方法中同时测定特定杂质E、F、G和未知杂质的含量，定量方法的选择为加或者不加校正因子的主成分自身对照法，此时需要明确在定量中需要用到自身对照的面积，那么本例中的积分重点是特定杂质E、F、G和自身对照的峰面积，在设置积分参数的时候，需要保证特定杂质E、F、G和自身对照的积分相对合理，即使出现主成分在供试品浓度下的色谱峰出现了积分过小的情况也没有影响，只要保证待测杂质和主成分自身对照的峰面积积分合理就能得到相对准确的测定结果。

综上所述，积分合理性是积分方法设置的前提，所谓积分合理就是保证待测定组分的积分没有过大或者过小，相对合适。在不同的定量环境中，积分方法的选择的侧重点是有差异的，比如外标法和主成分自身对照法中均需要保证在限度浓度水平中的积分是合理的，待测定的杂质的积分是合理的。在峰面积归一化的积分中，需要把所有的杂质和主峰均良好的积分，不必要的基线波动不能作为杂质峰积分，容易造成杂质定量中偏差。另外，在方法学验证中因为定量限检测限，强制降解试验的各自的特点，是允许单独的积分方法设置的。希望本文的中的积分方法的小设计可以给同行们的色谱图处理中带来一些参考。

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