两性分析物的离子交换色谱方法开发

你是否在进行多肽或蛋白质等两性分析物的质量研究时遇到这样的情况？某些杂质与主峰或杂质与杂质之间结构与极性极其相似，仅所带电荷有差异，采用RP-HPLC法无论怎样调整分离条件都无法分开这些杂质。这时可以考虑离子交换色谱法。

离子交换色谱的分离是基于离子型分析物与键合在固定相上的离子基的反离子的交换，依靠待分析组分表面电荷差异实现分离。在多肽及蛋白质的分子中普遍存在与主成分相关的电荷差异杂质，这些杂质会影响效力、PK、生物利用度、免疫原性和结构稳定性，因此基于电荷的方法是多肽和蛋白质表征研究及质量控制策略的重要组成部分。

离子交换分离原理

首先使待分析物和固定相带有不同电荷，产生相互作用，然后通过增加离子强度破坏两者的相互作用（盐浓度梯度）或者调节pH改变待分析组分表面电荷（pH梯度）来打破这种离子相互作用，实现洗脱目的，见图1。

图1 离子交换色谱法原理

离子交换方法开发

虽然分离机理不同，但离子交换色谱仍属于液相色谱范围，其方法开发思路与普通RP-HPLC方法有许多相同之处，需要考虑的因素包括以下几点：色谱柱类型、盐浓度、盐种类、流动相pH、梯度等。离子交换色谱法方法开发流程如下：

1 样品相关信息收集

当我们着手离子交换色谱法开发时，最好先获知待分析物PI值并考察待分析物在不同pH下的稳定性如何。这些信息对色谱柱选择和pH 的设定都具有很好的提示作用。

2 色谱柱选择

在离子交换色谱中色谱柱类型也代表分离模式，包括阳离子交换和阴离子交换两种。其中又可细分为强阳离子交换、弱阳离子交换、强阴离子交换和弱阴离子交换。阳离子交换柱色谱柱填料本身带负电荷，阴离子交换柱填料本身带正电荷。典型的固定相填料及适用pH范围见表1。

表1 典型固定相填料分类及适用pH范围

强离子交换柱可以在较宽pH范围内保持离子交换容量，弱离子交换柱则随pH变化改变交换容量。一般情况下首选强阳、强阴离子交换柱，选择性不好时考虑弱阳、弱阴离子交换柱。

关于色谱柱选择的一些经验见下表2。

表2 色谱柱选择

离子交换色谱法最初是应用在生物样品的纯化试验中，因为要确保待纯化组分的活性，尽量将pH设置在6-8之间，因此通常情况下，对于低PI物质，首选阴离子交换，高PI物质首选阳离子交换。例如某样品PI为5，推荐阴离子交换模式，pH设置为6；例如某样品PI为8.5，那么推荐阳离子交换柱，pH设置为7.5。

与纯化不同，在质量控制的方法开发中，对于待分析组分是否保持活性并不十分关注，只要确保仪器、色谱柱能耐受，pH设置范围可以更宽，因此对于采用阴离子交换模式还是阳离子交换模式并没有明显的规律。例如某样品PI为5，可以选择阴离子交换模式，pH设置为6进行盐梯度洗脱或pH设置为7~3进行pH梯度洗脱，也可以选择阳离子交换模式，pH设置为4进行盐梯度洗脱或pH设置为3~7进行pH梯度洗脱。

3 pH

首先，pH设置与所选择的色谱柱类型及待分析物的PI值息息相关。

①在盐浓度梯度条件下，pH为单一值，多为PI±1。阴离子模式下，pH为PI+1，因为阴离子交换柱填料带正电荷，当流动相pH高于PI时待分析物带负电荷，可以与柱填料产生相互作用而被保留，然后随着盐浓度增加逐渐解析下来；相反，阳离子模式下，pH为PI-1，因为阳离子交换柱填料带负电荷，当流动相pH低于PI时待分析物带正电荷，可以与柱填料产生相互作用而被保留，然后随着盐浓度增加逐渐解析下来。

②在pH梯度条件下，pH范围设置通常PI-2~PI+2，可依据杂质出峰时间和分离情况进一步优化。阴离子模式下，pH由高到低，因为阴离子交换柱填料带正电荷，当流动相pH高于PI时待分析物带负电荷，可以与柱填料产生相互作用而被保留，然后随着pH逐渐降低，带分析物的负电荷逐渐被中和，从而洗脱下来；阳离子模式下，pH由低到高，因为阳离子交换柱填料带负电荷，当流动相pH低于PI时待分析物带正电荷，可以与柱填料产生相互作用而被保留，然后随着pH逐渐降低，待分析物的正电荷逐渐被中和，从而洗脱下来。

其次，在pH选择时也要充分考虑待分析物的稳定性，如果待分析物在低于其pI的pH下稳定的，则应选择阳离子交换；如果待分析物在高于其pI的pH下稳定，则选择阴离子交换剂。

4 盐浓度

盐浓度通常情况下为10-50 mM，盐浓度选择与样品净电荷的多少有关，如果样品所带电荷较多或样品浓度较高，可以适当选择稍高一点的盐浓度，如50 mM，如果样品本身所带电荷较少或者样品浓度较低，可以选择稍低的盐浓度，如10 mM甚至是5 mM，但是要注意在低离子强度下，化合物与固定相间的疏水作用增强，可能在一定程度上存在多模式分离，可能会出现与预期的分离效果不符的情况，这种影响可能是正面的也可能是负面的，结合实际情况考虑是否需要增强这种疏水作用力。

5 盐种类

缓冲盐种类基本没有限制，只要在设定的pH范围内具有缓冲能力即可，磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、tris缓冲体系均可以尝试。

6 梯度

1）梯度类型

有盐浓度梯度和pH梯度，在检测效果不理想时也可以选择盐介导的pH梯度。

2）梯度变化速率

无论是盐浓度梯度还是pH梯度都是依据杂质的保留和分离情况来逐步调整的。这与RP-HPLC梯度思路调整相似，在杂质密集的部分可以适当降低梯度变化速率，在杂质较少的部分可以适当增快梯度变化速率。

小结

离子交换色谱法是检测电荷变异杂质的重要手段，这种技术首先是在在两性分析物（多肽、蛋白质、抗体等）的纯化中得到应用，在有关物质检测中的应用还相对较少，可查阅的文献也不多，相信随着对生物药物研究的深入，对其质量控制的要求会越来越高，离子交换色谱法的应用会越来越普遍。以上是我在实际工作中应用离子交换色谱的一些心得，希望能对正在或即将接触离子交换色谱法的同仁起到一些指导作用，同时，不够科学和严谨之处，也敬请批评指正。

参考文献：

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